Бесплатные осенние листья вектор ai svg

Бесплатные осенние листья вектор ai svg

ключевые слова

• желудь
• осень
• осенний лист
• Осенние листья
• холодное время года
• коллекция
• Осень
• осенние листья
• опавший лист
• Опавшие листья
• цветочный
• цветок
• лес
• фрукты
• лист
• листья
• клен
• естественный
• природа
• дуб
• объекты
• шаблон
• растение
• бесшовные модели
• время года
• корень
• дерево
• винтаж
• год
• ai
• svg
• Бесплатные
• осенние
• вектор

DMCA Contact Us

бесплатная загрузка ( ai svg, 623.12KB )

Связанная векторная графика

• Осенние листья вектор eps
• org/ImageObject»> Лист Осень eps
• Осеннее дерево без листьев svg eps
• Бесшовный образец льняных осенних листьев
• Бесплатные листья 2 векторов ai svg
• Яркие осенние листья векторные фоны eps
• Шаблон флаера осеннего фестиваля psd
• Осенние листья с вектором дождя eps
• Бесплатные осенние листья вектор svg ai
• три осенних баннера с разноцветными листьями вектор eps
• три продажи осенние баннеры с листьями вектор eps
• Солнечное небо на фоне зеленых листьев (бесплатно) eps ai
• Бесплатные текстуры полигональных листьев eps
• Вектор Осенний фон с красочными осенними листьями ai
• Зеленый весенний фон дерева с листьями (бесплатно) eps ai
• Осенний лист вектор eps
• Продажа этикеток с осенними листьями вектор eps
• Бесплатная графика: Векторный силуэт листа ai csh
• Осенние листья фон ai
• Красивые осенние листья eps
• Коллекция тропических листьев eps
• Красивый осенний лист eps
• Красивые осенние листья eps
• Желтые осенние листья Векторный фон набор eps
• Бесплатный образец осенних листьев svg ai
• Корпоративная бесплатная визитка psd
• Бесплатные тропические листья векторов svg ai
• Яркие осенние листья стола Векторный набор eps ai
• Записать текстовый стиль бесплатно PSD psd
• Осенние листья с фруктами вектор eps
• Осенняя композиция из листьев eps
• 3d текст и осенние листья фон вектор eps
• Красивый осенний лист eps
• Красивые осенние листья eps
• Вектор осенние листья фоны искусства eps
• Осенние фоны с акварельными оранжевыми, желтыми и зелеными листьями eps
• Бесшовные осенние листья узор векторов материала eps
• Дизайн Векторная графика Осенний лист 1 eps
• Бесшовный образец листа svg eps
• Кривая осенние листья векторная графика eps
• Бесплатные осенние листья Векторный фон eps svg
• Осенние листья вектор 4 графический дизайн eps
• Осенние листья вектор ai
• Осенние листья бесплатно акварель ai svg
• Осенние листья силуэты ai
• Бесплатная творческая визитка psd
• Бесплатный вектор Versace svg eps
• Яркие осенние листья векторные фоны eps
• Набор осенних кленовых листьев иллюстрации вектора eps
• Бесплатный логотип природных водных листьев ai

Загрузи больше

• Contact Us

Мурашко оценил эффективность вакцины «Спутник V» среди подростков

Михаил Мурашко © пресс-служба Госдумы

Эффект от российской вакцины «Спутник V» для подростков и взрослых будет сопоставим, заявил глава Минздрава Михаил Мурашко. Об этом в понедельник сообщает РИА «Новости».

Клинические исследования вакцины «Спутник V» среди подростков начались в июле в Москве. Как отмечал главный внештатный специалист по детской гематологии Минздрава, директор центра имени Рогачева Александр Румянцев, испытания препарата на подростках не несут никаких рисков для участников исследования, их привьют уменьшенной дозой вакцины.

«Мы получили сейчас объёмы данных по вакцинным препаратам колоссальные, переходя непосредственно на ту часть детского населения, подростков, мы понимаем, что метаболизм и эффект от этого препарата будет сопоставим», — сказал Мурашко на пленарной сессии медицинского форума.

23 сентября Министерство здравоохранения России получило документы на регистрацию вакцины от коронавирусной инфекции для подростков. Как отмечал помощник министра здравоохранения Алексей Кузнецов, вакцинация подростков в случае регистрации вакцины будет исключительно добровольной и проводиться только при наличии согласия родителей или законных представителей.

Ранее врач-педиатр, инфекционист, вакцинолог Евгений Тимаков рассказал «Парламентской газете», что дети стали гораздо чаще заболевать коронавирусом, причём независимо от возраста и иногда с серьёзными осложнениями. Специалист пояснил, почему так происходит, насколько мутации вируса опасны для детей и нужно ли их массово прививать от инфекции. 

Сейчас в России зарегистрировано пять препаратов для профилактики коронавирусной инфекции: «Спутник V» и «Спутник Лайт» (разработчик — Центр имени Гамалеи), разработанные Центром «Вектор» «ЭпиВакКорона» и «ЭпиВакКорона-Н», а также и «КовиВак» Центра имени Чумакова. «Парламентская газета» разбиралась, как работают вакцины от коронавируса и чем они отличаются. 

За сутки с улиц Рязани убрали 119 кубометра смета и 63 кубометра грунтовых наносов

В областном центре продолжается работа по уборке, – сообщает администрация Рязани. Сегодня в работе задействованы 162 сотрудника и 79 единиц техники дирекции благоустройства. На улицах Подгорной, Скоморошинской, Урицкого, Фирсова, в Газетном переулке бригады мехуборки убирали прилотковую часть дороги. Газоны выкашивали на улицах Зубковой, Быстрецкой, Промышленной. На аллее Олимпийской славы перекапывали клумбы, в сквере им. А.В. Александрова подстригли кустарник, у Дворца торжеств провели обрезку роз. На улицах Пушкина, Братиславской, Первомайском проспекте, сквере «Юность» вместо не прижившихся и сломанных деревьев были посажены 19 саженцев липы.
За сутки с городских территорий убрано 119 кубических метров смета и 63 кубических метра грунтовых наносов. Подбор осуществлялся на улицах Садовой, Вознесенской, Птицеводов, Зафабричной, Костычева.
Вчера аварийные деревья спилили на улицах Белякова, Великанова, Ленинского комсомола. С улицы Дзержинского вывезли более 8 кубометров древесных отходов. Сорную растительность удалили на Московском шоссе, Тракторном проезде и проезде Яблочкова. Из сквера им. В.Ф. Уткина вывезли собранные листья.
Ночью проезжую часть дорог подметали на улицах Урицкого, Новой, Касимовском шоссе, Кальной, Затинной, Свободы, Циолковского, Есенина, Грибоедова, Фирсова, Лермонтова, Радиозаводской, Электрозаводской, Спортивной, Горького, Зубковой, Куйбышевском шоссе, Советской армии, Новоселов, Тимуровцев, Солотчинском шоссе, Подгорной, Ленина, Радищева, Каширина, Кудрявцева, Маяковского, Первомайском проспекте, Вокзальной, Михайловском шоссе, Типанова, Татарской, Дзержинского, Высоковольтной, Юбилейной, Крупской, Новаторов, Костычева, Мервинской, 7-м Мервинском проезде, Народном бульваре, Великанова, Октябрьской, Магистральной, Забайкальской, Авиационной, Интернациональной, Княжье поле, Семчинской, Бирюзова, Молодцова, Станкозаводской, проезде Шабулина, Московском шоссе, Космонавтов, Сельских строителей, разворотном круге общественного транспорта в микрорайоне Недостоево, дороге на Кожзавод, Дачной, Центральной, Промышленной, Молодежной, 1-й Красной, Гагарина, Островского, Чкалова, Стройкова, Черновицкой, Ленинского комсомола, Октябрьском городке.

Фото: администрации Рязани

Мне нравитсяНе нравится

Пять главных вопросов о Всероссийской переписи населения

В этот раз она пройдёт с 15 октября по 14 ноября.

Через два дня в России начнётся очередная перепись населения. Зачем она нужна, для чего принимать в ней участие и как изменится процесс из-за пандемии коронавируса в нашем материале.

1. Зачем нужна перепись населения?

Самая главная цель – собрать как можно больше актуальных данных о том, кто и как живет в стране. Исходя именно из этой информации в последствии будет сформирована социальная политика государства.

От количества проживающих человек в конкретном населенном пункте, а также их уровня образования, национального состава и так далее будет зависеть дальнейший вектор развития того или иного региона. Например, такие данные помогут модернизировать и реализовать новые проекты в сфере образования, медицины и строительства, определить, какие льготы особенно актуальны, скорректировать размер выплат, например материнского капитала.

Полученную информацию будут использовать в национальных проектах. Перепись населения — самый эффективный и зачастую единственный способ получить эту информацию и на ее основе определить, сколько в стране жителей, какие проблемы у них есть.

2. Почему перепись проводят один раз в десять лет?

Мировой опыт показал, что десять лет – оптимальный временной период. Такую практику инициировала Организация Объединенных Наций, в которую входит и Россия.

3. Какие вопросы будут задавать?

Каждому участнику предложат три вида бланков для опросов. Они имеют три формы.

Форма Л включает 23 вопроса для тех, кто постоянно живет в России. Здесь нужно будет ответить на вопросы о поле, возрасте, профессиональной занятости, владении иностранными языками, состоянии в браке, количестве детей, источниках дохода и других социально-экономических показателях.

Форма П содержит 10 вопросов о жилье: какого года постройки дом и из какого материала сделаны стены, какова площадь и сколько комнат в доме/квартире.

Бланк формы В – для иностранцев, временно проживающих в России. Им нужно будет ответить на семь вопросов, в том числе о цели приезда в Россию.

Вместе с этим участников не будут спрашивать о размерах дохода, не спросят, кому принадлежит жильё и не будут просить показать паспорт, однако уточнить фамилию, имя и отчество переписчики могут, чтобы одного человека не опросили дважды.

По правилам, человек может отказаться сообщать свою фамилию. Для конфиденциальности информация о фамилии, имени и отчестве не будет храниться вместе с переписным листом.

4. Как понять, что перед вами переписчик?

Переписчик обязательно покажет вам удостоверение и свой паспорт. Обязательные атрибуты переписчика — синий портфель с надписью «Росстат», синий шарф с надписью ПН-2020, жилет со светоотражающими полосами и планшет со специальным программным обеспечением.

Узнать своего переписчика можно по номеру телефона вашего переписного участка или позвонив на горячую линию: +7 800 707-20-20.

5. Как будет проводиться перепись в 2021 году?

Перепись будет проходить в течение месяца. В любой день к вам может прийти переписчик.

Однако россияне могут сами заполнить электронные переписные листы на портале госуслуг, но только с 15 октября по 8 ноября. После заполнения листа на электронную почту и на мобильный телефон придет QR-код. Его нужно показать переписчику, который придет домой. Это нужно, чтобы избежать дублирования записей в базе данных. Перепись на портале госуслуг также можно пройти во всех центрах госуслуг «Мои документы».

Русија о крађи формуле за вакцину: Оптужбе британског листа апсолутно немају смисла

https://rs.sputniknews.com/20211011/rusija-o-kradji-formule-za-vakcinu-optuzbe-britanskog-lista-apsolutno-nemaju-smisla-1130589642.html

Русија о крађи формуле за вакцину: Оптужбе британског листа апсолутно немају смисла

Русија о крађи формуле за вакцину: Оптужбе британског листа апсолутно немају смисла

Објава у британском листу „Сан“ о томе да су приликом прављења руске вакцине против вируса корона „Спутњик Ве“ (Sputnik V) коришћени подаци за вакцину… 11.10.2021, Sputnik Србија

2021-10-11T17:46+0200

2021-10-11T17:46+0200

2021-10-11T17:46+0200

русија

русија

британски таблоид

вирус корона се шири планетом

спутњик ве (sputnik v)

астразенека

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdnn1.img.rs.sputniknews.com/img/07e5/06/0c/1125596089_0:160:3073:1888_1920x0_80_0_0_5ab2cf8deae285398749ffbf0f082473.jpg

РФПИ подсећа да је вакцина „Спутњик Ве“ заснована на добро проученој хуманој аденовирусној платформи која се деценијама показала као ефикасна и безбедна. Истовремено, „АстраЗенека“ користи за своју вакцину аденовирусни вектор шимпанзе.Притом, творци руске вакцине и „АстраЗенека“ спроводе заједничка клиничка испитивања, подсећа руска страна.„Уместо што шире лажне вести, британски медији и државне службе би требало да боље штите репутацију ‘АстраЗенеке’, безбедне и ефикасне вакцине која је стално изложена нападима конкурената у медијима посредством чињеница извучених из контекста“, додаје се у саопштењу РФПИ.Портпарол премијера Велике Британије Бориса Џонсона одбио је да коментарише писања таблоида „Сан“ о наводној крађи формуле вакцине, преноси телевизија „Скај њуз“.Позивајући се на своје изворе, таблоид „Сан“ је објавио да је Русија наводно украла формулу за вакцину компаније „Астра зенека“ и употребиле је за развој руске вакцине против ковида „Спутњик Ве“. Коментаришући ову вест, портпарол Кремља Дмитриј Песков рекао је да су „новине ‘Сан’ веома познате као дубоко ненаучни лист, па се руска страна тако и односи према овим објавама“.Директор Центра „Гамалеја“, који производи ову вакцину, Александар Гинцбур је у априлу изјавио да је верзија о крађи формуле најсмешнији мит о „Спутњику Ве“.

https://rs.sputniknews.com/20211011/peskov-odgovorio-na-optuzbe-britanskog-tabloida-duboko-nenaucni-list-1130570428.html

Maximovic

Па тужити британске, „новинарске шимпанзе“ за клевету, нарушавање угледа и све што следује. Просто ко шебој?

1

Sputnik Србија

[email protected]

+74956456601

MIA „Rosiya Segodnya“

2021

Sputnik Србија

[email protected]

+74956456601

MIA „Rosiya Segodnya“

Вести

sr_RS

Sputnik Србија

[email protected]

+74956456601

MIA „Rosiya Segodnya“

https://cdnn1.img.rs.sputniknews.com/img/07e5/06/0c/1125596089_170:0:2901:2048_1920x0_80_0_0_40572cde5069ede8c1764334c8cb38b6.jpg

Sputnik Србија

[email protected]

+74956456601

MIA „Rosiya Segodnya“

Sputnik Србија

[email protected]

+74956456601

MIA „Rosiya Segodnya“

русија, британски таблоид, вирус корона се шири планетом, спутњик ве (sputnik v), астразенека

Објава у британском листу „Сан“ о томе да су приликом прављења руске вакцине против вируса корона „Спутњик Ве“ (Sputnik V) коришћени подаци за вакцину „АстраЗенека“ је још једна лажна вест која нема смисла са научне тачке гледишта, саопштио је Руски фонд за директне инвестиције (РФПИ) на Твитеру.

„Објава листа ‘Сан’ је још једна лажна вест и дрска лаж, заснована на анонимним изворима. Причу, коју је покренуо таблоид ‘Сан’, промовишу противници успеха једне од најефикаснијих и најбезбеднијих вакцина против ковида 19 на свету. Сматрамо да су такви напади крајње неетички, јер подривају глобалне напоре за вакцинацију. Такође, они немају никаквог смисла са научне тачке гледишта, пошто ‘Спутњик Ве’ и ‘АстраЗенека’ користе различите платформе“, наводи се у саопштењу.

РФПИ подсећа да је вакцина „Спутњик Ве“ заснована на добро проученој хуманој аденовирусној платформи која се деценијама показала као ефикасна и безбедна. Истовремено, „АстраЗенека“ користи за своју вакцину аденовирусни вектор шимпанзе.

Притом, творци руске вакцине и „АстраЗенека“ спроводе заједничка клиничка испитивања, подсећа руска страна.

„Уместо што шире лажне вести, британски медији и државне службе би требало да боље штите репутацију ‘АстраЗенеке’, безбедне и ефикасне вакцине која је стално изложена нападима конкурената у медијима посредством чињеница извучених из контекста“, додаје се у саопштењу РФПИ.

Портпарол премијера Велике Британије Бориса Џонсона одбио је да коментарише писања таблоида „Сан“ о наводној крађи формуле вакцине, преноси телевизија „Скај њуз“.

Позивајући се на своје изворе, таблоид „Сан“ је објавио да је Русија наводно украла формулу за вакцину компаније „Астра зенека“ и употребиле је за развој руске вакцине против ковида „Спутњик Ве“.

Коментаришући ову вест, портпарол Кремља Дмитриј Песков рекао је да су „новине ‘Сан’ веома познате као дубоко ненаучни лист, па се руска страна тако и односи према овим објавама“.

Директор Центра „Гамалеја“, који производи ову вакцину, Александар Гинцбур је у априлу изјавио да је верзија о крађи формуле најсмешнији мит о „Спутњику Ве“.

Песков одговорио на оптужбе британског таблоида: Дубоко ненаучни лист

Листья разного цвета картинки — Советы садоводам и огородникам

Шаблоны листьев для вырезания из бумаги

Шаблоны листьев для вырезания из бумаги

В летний период листики имеют зеленый окрас, но осенью, все они приобретают особенный оттенок: алый, желтый, оранжевый коричневый. Чтобы не собирать листья на улице, на много проще сделать все самостоятельно, достаточно иметь под рукой шаблоны листьев для вырезания из бумаги.

Как получить шаблон

Поделки из бумаги очень популярны у детей, особенно часто в этом виде творчества возникает необходимость в детских садиках и школах. Но, что делать если нужно срочно создать осеннее панно или композицию, а материала нужного нет? Предлагаем вам не останавливаться перед творческим процессом, и быстро сделать нужные листики. Остается вопрос, как эти листики можно получить?

Не только детям, порой и взрослым, сложно нарисовать листы самостоятельно. Например, кленовый лист, изобразить просто, а с зубчиками березового справиться уже сложнее. Мы собрали для вас самые популярные шаблоны листьев для вырезания из бумаги, которые выручат вас, если нужно срочно заняться поделкой.

Шаблон цветных листьев

Получить готовый листик можно разным способом:

• приложите тонкий лист к рисунку на мониторе, и аккуратно не надавливая перерисуйте листик;
• распечатайте заготовки на принтере, раскрасьте и используйте по назначению.

Кстати, раскрасить шаблоны листьев для вырезания из бумаги можно на компьютере. Просто скачайте образец и оформите его нужными красками, такой листик получится очень ярким. Ну, а для тех, кто экономит время, есть уже готовые цветные шаблоны. Их достаточно просто распечатать и использовать в поделке.

Как сделать прочные шаблоны

Сегодня в продаже есть много трафаретов сделанных из пластика. Можно приобрести и фигурки животных, и овощи, и конечно же осенние листья. К чему тратить деньги? Если вы уверены, что необходимость в осенних листиках у вас появится не однократно, предлагаем вам сделать многоразовые трафареты.

Изготовление прочного шаблона

Выберите один из предложенных нами шаблонов:

• березовый лист;
• кленовый лист;
• дубовый лист.

Обратите внимание, что эти шаблоны необычные. Они рассчитаны для поделок и создания вытынанок.

Что нужно сделать дальше:

• выбранный шаблон листьев для вырезания из бумаги распечатать;
• вырезаем листик по контуру, чтобы все мелкие детали были соблюдены, лучше использовать маникюрные ножницы;
• мелкие элементы внутри вырезайте ножом для канцелярских работ;
• чтобы не повредить рабочий стол, обязательно подстелите доску, она будет заключаться в ламинировании;
• чтобы провести ламинирование в домашних условиях, возьмите утюг и специальную пленку;
• кладем пленку на листок и проглаживаем утюгом на низкой температуре, использовать большую температуру нельзя, пленка может испортиться;
• когда материал будет заламинирован, вырезаем листья. Шаблон кленовых листьев

Трафарет листьев для вырезания из бумаги шаблоны, которых вы видите на примере может выручить. С их помощью может получиться много листиков для поделки. Использовать готовый образец листьев можно на окнах или дверях.

Использовав такой трафарет один раз, не выкидывайте, сложите листики в коробочку или конверт, доставайте, если нужно сделать новую поделку. Такие прочные шаблоны испортятся не скоро.

Что можно делать с трафаретами

Разнообразие вариантов поделок впечатляет. Представьте, сколько применений и увлекательных занятий может повлечь за собой всего несколько шаблонов с осенними листиками. Все что требуется от вас это трафареты для вырезания из бумаги распечатать, дальше уже дело фантазии.

Вот несколько идей использования готовых шаблонов:

1. Предложите ребенку взять самый простой шаблон и самостоятельно вырезать ножницами. Дайте фломастеры, и малыш по своему усмотрению сможет нарисовать листику прожилки и раскрасить его.
2. Очень красиво смотрятся окна, на которых наклеены распечатанные и ярко раскрашенные листочки. Листопад не закончится никогда. Даже в пасмурную или дождливую погоду за окном. А когда наступит зима, вы сможете заменить листья вырезанными снежинками по шаблону. Ветка ясеня
3. Осенние листья, подвешенные к потолку на леске, обязательно поднимут настроение. Если раньше вы делали вытынанки, то рекомендуем использовать именно такие шаблоны. Листики получаются почти прозрачными и ажурными. Чтобы достичь такого эффекта, рекомендуем использовать макетный нож. Он поможет детально прорезать элементы на трафаретах для вырезания из бумаги. Листики вытынанки

Кроме этих идей предлагаем вам сделать не просто осенние листики. Создайте из них настоящую яркую композицию. Над созданием могут работать дети. Для примера используйте нашу поделку, в которой задействованы простые материалы.

• шаблоны разных листьев для вырезания из бумаги;
• краски, выбирайте цвета, которые помогут получить осенние расцветки у листьев;
• бумага;
• поролон;
• кисточка;
• скотч для малярных работ;
• высушенная ветка от дерева;
• флористическая проволока;
• ножницы.

Первое, что нужно сделать, это выбрать шаблон листьев для вырезания из бумаги и распечатать его. Если возможности использовать принтер нет, прикладываем бумагу к монитору и обводим контуры карандашом. Не нажимайте на экран, лучше нанести легкий набросок и уже на столе прорисовать мелкие детали и навести контуры. Вырезаем подготовленные листики.

Описанная техника позволяет получить совершенно любой лист, но самые красивые листы, конечно же у клена. Именно его шаблон мы и будем использовать в дальнейшей работе.

Что делать дальше:

1. Используя флористическую проволоку, скручиваем прожилки будущих листиков. Только так наша поделка приобретет реалистичный вид. Присоединяем прожилки к шаблонам листьев с помощью малярного скотча.
2. Теперь пришло время окрасить те шаблоны листьев для вырезания из бумаги, которые распечатали и соединили с проволокой. Используем губку. Ей наносим краску на поверхность бумаги. Лучше пользоваться сразу несколькими цветами. Так получится неоднородный и более естественный, а главное красивый цвет.
3. Когда весь окрашенный материал высох, фиксируем каждый листочек на черешке ветки.

Оригинальная поделка или красивый декор для вашего дома готов.

Шаблон вытынанки

Использовать шаблоны можно и для создания красивого осеннего венка. Выбирайте разные листочки. И самое главное не использовать при окрашивании одинаковые цвета. Здесь листья могут быть и зелеными, и красными, и желтыми. Добавьте к листикам четкие прожилки и венок будет смотреться как настоящий.

Шаблоны для поделок в школу

Каждый ребенок независимо от того, посещает он сад или школьное учреждение любит собирать осенние листья. Они красивые и яркие и всегда можно найти листик больше и красивее предыдущего.

Не менее интересно вырезать их и из бумаги. Задание несложное, и конечно веселое. Могут появиться при использовании шаблонов листьев для вырезания из бумаги и сложности, например, с маленькими деталями. Здесь детям придется помочь, ну а школьники вполне справятся с задачей вырезания по контуру.

Что можно сделать, используя шаблоны:

• осенние гирлянды;
• декоративные украшения для школьных окон или классной доски;
• плакаты;
• стенгазеты с осенней тематикой;
• поздравительные открытки;
• венки;
• аппликации;
• украшения для подвешивания на потолок;
• украшения для дверей;
• пейзажи;
• художественные композиции.

Все эти и многие другие невероятные поделки можно сделав заручившись шаблонами, бумагой и красками.

Осень может каждого удивить палитрой красок и волшебством падающих листьев. Оторвавшийся от дерева листик, падая, исполняет свой последний танец перед приходом зимы.

Не обязательно собирать листья на улице. Сделать свой собственный листопад можно используя обычные шаблоны. Образцы самых красивых листьев деревьев, мы собрали именно для вас.

Названия деревьев и их листья. Картинки. Раскраски.

Вроде бы живет ребенок в этом мире, с детства ходит гулять в парк, слышит от мамы названия деревьев, собирает листья в букеты, а к шести-семи годам оказывается, что он из всех деревьев запомнил одну березу, и то потому, что ствол белый и не похож ни на какой другой. А про листья и не спрашивайте, мало кто из ребятишек ответит, чьи же листики валяются под ногами, от какого деревца. Уделим внимание этой теме, поучим и закрепим названия деревьев и то, как выглядят их листочки. А летом снова в парк — повторять и еще раз повторять.

Картинки деревья и их листики

Для начала рассмотрим с ребенком изображения. На рисунках дерево, его листья и семена. Пусть малыш сам своими словами опишет, какое дерево, какой у него ствол, какие листочки, их особенности. Смотрим и запоминаем.

И еще один набор карточек про деревья:

Теперь можно перейти к закреплению материала. Предложите ученику раскрасить листья деревьев.

Раскраски

А теперь можно потренироваться самостоятельно нарисовать листья деревьев.

Ребенку сложно запомнить то, что ему не интересно, так заинтересуйте его! Соберите букет самых красивых осенних листьев, где каждый листочек выбран с душой и любовью, и поставьте его дома. Или сделайте из них поделку-аппликацию. И названия лучше закрепятся в памяти вашего чада.

Осенние листья из бумаги: трафареты и шаблоны для распечатки и вырезания

Здравствуйте читатели гости блога page365.ru!

Как настроение? Наверно грустите из-за погоды, возможно она пасмурная иили чересчур солнечная? А хотите его поднять? Тогда предлагаю выполнить несложную работу по созданию чудных творений в виде осенних листочков. Которыми вы можете украсить свой интерьер в доме или принести в детский садик или школу и оформить ими класс, приемную и даже концертный зал. А почему собственно нет? Ведь эти красивые мелочи жизни будут радовать глаз.

Предлагаю вашему вниманию подборку интересных идей и мастер-классов того, как сделать осенние листья разными способами из бумаги. При этом в статье будут даны как шаблоны с трафаретами, так и просто шаги по работе. Справится хоть новичок, хоть ребенок.

Что ж не сидите дома зря, творите на радость всем. А заодно еще можете заглянуть ком не в гости в другие статьи на похожую тематику, это могут быть поделки из овощей и фруктов, тыквы, открытки и даже сувениры из листьев деревьев. Которые отлично впишутся, если в вашем учебном заведении проводятся выставки или конкурсы.

Итак, вперед творчеству и вдохновению! Смотрите и повторяйте, надеюсь что заметка всем понравится и вы непременно добавите ее в закладки браузера и поделитесь в социальных сетях классами. Удачи!

Осенний лист — шаблон для распечатки и вырезания

Начнем пожалуй с самых легкий идей. А почему именно с них? Да, потому что вы быстренько можете взять любой шаблон и положить к экрану монитора белый лист бумаги и обвести заготовку. Вуаля, ножницы вперед и чудо картинка готова. Или же если у вас есть принтер, нажимайте на печать и распечатывайте фото.

Таким образом в вашем арсенале будет все, что надо для креативных задумок, да и скучать не придется. Детям поручите раскрашивать листочки или же берите цветные трафареты. В данной подборке есть и те, и другие виды работ.

Как например, вам эти образцы, в них представлены разные разновидности, как видите это и береза, и рябина, клен, осина и т.п. Вы какой листок дерева ищите?

Мастер-класс по созданию осенних листьев из гофрированной бумаги для детского сада

Давайте вместе с детишками создадим целую композицию в виде осенней веточки с желто-оранжевыми листиками из гофрированной бумаги. Правда это будет совместная работа, потому что использоваться будет клеевой пистолет. Думаю, никто против не будет! Читайте этот инструктаж и творите!

Источник https://youtu.be/kqHE8uo2NcU

Понадобится:

• желтая, оранжевая, коричневая гофрированная бумага
• проволока
• горячий пистолет
• ножницы
• акварельные краски

Этапы:

1. Разрежьте прямоугольную заготовку по диагонали, как показано на фото.

2. Затем пройдитесь клеевым пистолетом и приклейте проволоку.

3. Приложите второй листик гофрированной бумаги сверху.

4. И дождитесь, когда клей высохнет и остынет.

Важно! Всю эту работу делает взрослый, а вот следующий этап — доверьте ребенку или работайте коллективно.

5. Придайте форму ножницами заготовке.

6. Самый интересный момент, нанесите акварель на листики и дайте полностью высохнуть.

7. Задекорируйте стебелек коричневой лентой, капнув капельку клея на основание заготовки. Далее создайте веточку, объединив все детали между собой и склеив их коричневой бумагой или тейп-лентой.

Также хочется еще показать другую работу в виде аппликации. Только она будет слегка необычной, поскольку лист будет создаваться из кусочков разноцветной бумаги. Предложите детям ее нарвать руками любой формы. А вот подложку, используйте в виде пергамента для выпечки -смажьте клеем по всей поверхности.

Выложите все обрывки и каждую заготовку также смажьте клеем для декупажа.

Как только работа подсохнет, уложите трафарет и сделайте контур, а после вырежьте.

Получится вот такая классная поделка на окна.

Как сделать осенний листок в технике «гармошка»

Кленовые листья самые распространенные, в мире поделок на тему Осени. А почему? Все потому что они такие красивые! Поэтому обязательно берите эти работы себе на заметку.

Нам понадобится:

• бумага цветная формата А4
• клей
• ножницы
• карандаш

Этапы:

1. Возьмите любой лист цветной бумаги, выберите любой цвет, но лучше брать не зеленый. Так как тогда он не отобразит осеннюю тематику. Сложите его в два раза и приложите к линии сгиба шаблон, и обведите контуры карандашом.

Шаблон

2. Теперь, как вы и догадались — берите ножницы в руки и вырезайте.

3. После чего сверните заготовку в виде гармошки, лучше будет, если она будет не сильно крупная, как показано на фото.

4. Согните листок пополам, чтобы получилась линия сгиба.

5. Для стебелька сверните или скрутите обычный лист прямоугольной формы, только он конечно же должен быть не широкий, примерно 1 см на 15 см. И зафиксируйте им серединку.

6. А вот части листка склейте клеем-карандашом аккуратно и красиво.

7. Таким образом получился обворожительный кленовый листочек.

Картинки осенних листьев для оформления, распечатки и вырезания

И вновь по просьбе читателей публикую еще множество шаблонов с картинками из осенних листьев. Многие просили композиции из букетов листьев, так вот из заготовок можете их создать, ловите друзья и пишите, если они вам понравились. Также можно прописать, чтобы вы еще хотели увидеть на страницах сайта. Вообщем чудите на здоровье, ведь осень в самом рагаре, или только началась в вашей местности? А может уже поздняя пора пришла.

В любом случае все эти образцы украсят любой предстоящий праздник, получится фантастически красиво. У нас каждый год воспитатели в детском саду оформляют раздевалку такими гирляндами «творинками», а детишки просто в восторге от увиденного. Ведь они их могут запросто раскрасить по образцу. Как например тут:

Ну, а теперь как и обещала обещанные трафареты.

Кстати, можно еще вытворять поделки используя стиль вытынанок. Причем для долговечности их можно заламинировать специальной бумагой при помощи утюга или обклеить скотчем.

Объемные кленовые листья в технике оригами для детей

Для тех, кто просто обожает бумагу и часами может сидеть и что-то из нее выделывать, конструировать, тому данная поэтапная инструкция поможет покорить новые высоты. Оказывается даже символ осени можно создать в технике оригами. И к тому же вариантов создания масса. Вы представляете? Круто, я бы сказала.

Смотрите этот ролик с канала ютуб и у вас непременно все получится. Кленовые листочки прекрасны, как в живую, так и в поделках.

А вот еще другие идеи, техника тоже оригами, но сам процесс изготовления абсолютно иной.

Или берите вот эти подсказки:

Работу также можно выполнить в стиле квиллинга, такие листочки ну просто чудесны, правда с ними придется повозиться. Из цветных полосок вам необходимо накрутить колечки, а после приложить трафарет на лист и обвести, именно на нем и будет создаваться картинка. Смотрите схемку:

А вот и шаблон, который понадобится:

После переходите к инструкции, весь МК показан ниже в картинках:

А вот какой очаровательный итог.

На этом заканчиваю пост и хочу, чтобы ваши осенние листочки выглядели очаровательно там куда вы их присадите и привесите. Жду от всех отзывов и пожеланий. Если понравилась заметка нажимайте по кнопочкам социальных сетях.

До свидания. Заходите на блог почаще, буду рада видеть вновь.

Химический состав и инсектицидная активность эфирного масла листьев Aeollanthus pubescens против Anopheles gambiae sensu stricto

Фон: Чрезмерное использование синтетических инсектицидов является причиной многих случаев резистентности насекомых. Следовательно, использование природных молекул, представляющих экологический интерес, с инсектицидными свойствами — это альтернативный подход к использованию синтетических инсектицидов.Целью данного исследования является изучение ларвицидной и взрослой активности, а также химического состава эфирного масла Aeollanthus pubescens в отношении основного переносчика малярии, Anopheles gambiae.

Методы: В этом исследовании использовались три эталонных штамма Anopheles gambiae sensu stricto (Kisumu, Kiskdr и Acerkis). Листья A. pubescens были собраны на юге Бенина.Использовались стандартные рекомендации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по оценке ларвицидов, а химический состав эфирного масла анализировался с помощью газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Взрослых комаров каждого штамма подвергали воздействию кусков сетки, покрытых эфирным маслом, в течение 3 минут с использованием метода биотестирования конусов ВОЗ. Пробит-регрессионный анализ использовался для определения концентраций, которые убили бы 50 и 95% каждой тестовой популяции (LC ₅₀ , LC ₉₅ ) и времени нокдауна для 50 и 95% каждой тестовой популяции (KDT ₅₀ , и КДТ ₉₅ ).Разница между регрессиями смертности и дозы для разных штаммов была проанализирована с использованием теста отношения правдоподобия (LRT). Для оценки разницы в выживаемости между штаммами был проведен лог-ранговый тест.

Полученные результаты: Всего было идентифицировано 14 компонентов, что составляет 98,3% от общего содержания нефти. Основными компонентами были карвакрол (51,1%), тимилацетат (14.0%) и ɣ-терпинен (10,6%). Эфирное масло показало ларвицидные свойства в отношении штаммов Kisumu, Acerkis и Kiskdr, с LC ₅₀ 29,6, 22,9 и 28,4 частей на миллион, соответственно. С кусками сетки, обработанными при 165 мкг / см ² , KDT ₅₀ как Acerkis (1,71 с; Z = 3,34, P <0,001), так и Kiskdr (2,67 с; Z = 3,49, P <0,001) были значительно ниже, чем у Кисуму (3,8 с). Продолжительность жизни трех штаммов комаров снизилась до 1 дня для Кисуму (χ ² = 99, df = 1, P <0.001), 2 дня для Acerkis (χ ² = 117, df = 1, P <0,001) и 3 дня для Kiskdr (χ ² = 96,9, df = 1, P <0,001).

Заключение: Наши результаты показывают, что эфирное масло A. pubescens обладает ларвицидными и взрослыми свойствами против переносчика малярии An. gambiae sensu stricto, предполагая, что это эфирное масло может быть потенциальным кандидатом для борьбы с устойчивыми переносчиками малярии.

Ключевые слова: Aeollanthus pubescens; Anopheles gambiae; Биоинсектицидная активность; Эфирное масло.

Границы | Катион / Са2 + обменник 1 (MdCCX1), переносчик Na +, локализованный на плазменной мембране, повышает толерантность растений к соли, ингибируя чрезмерное накопление Na + и активных форм кислорода

Введение

Засоление земель все более пагубно сказывается на воспроизводстве растений и продуктивности сельского хозяйства, поскольку большинство видов растений чувствительны к высоким концентрациям натрия.Высокая засоленность может привести к осмотическому стрессу, нарушающему многие физиологические и биохимические процессы растений. Солеустойчивость растений — это сложный признак, в котором задействованы многочисленные физиологические и биохимические механизмы и многочисленные гены. Понимание генетических и молекулярных механизмов, лежащих в основе солевой толерантности, необходимо для решения таких проблем.

У растений выработалось множество механизмов, позволяющих справляться с высокой засоленностью. Теоретически можно использовать три механизма для предотвращения избыточного накопления Na ⁺ в растениях (Keisham et al., 2018). Во-первых, проникновение Na ⁺ в клетки корней растений может быть ограничено ионными каналами, такими как неселективные катионные каналы (NSCC) и транспортерами, такими как HAK5 и HKT. Во-вторых, Na ⁺ , попадающий в клетки, может транспортироваться и храниться в вакуолях. Вакуолярная компартментация — это эффективная стратегия растительных клеток для борьбы с солевым стрессом, улучшающая осмотическое регулирование. Например, известно, что галофиты, естественно приспособленные к высокой солености, накапливают большие количества Na ⁺ в вакуоли (Barros et al., 2021). Сходные паттерны для компартментации Na ⁺ вакуолярными антипортерами Na ⁺ / H ⁺ были обнаружены у Arabidopsis и томата (Yokoi et al., 2002; Galvez et al., 2012). В-третьих, цитозольный Na ⁺ может экспортироваться обратно в питательную среду или апопластные пространства. Ожидается, что антипортеры Na ⁺ / H ⁺ на плазматической мембране будут выполнять эту функцию, например, SOS1 (Olias et al., 2009; Nie et al., 2015; Che et al., 2019).

Регуляция ионного баланса, особенно Na ⁺ , связана с различными генами, включая SOS1 , NHX1 , HKT1 .Исследования показали, что белки семейства катион / Ca ²⁺ (CCX) участвуют в регуляции Na ⁺ . Белки CCX принадлежат к суперсемейству CaCA (Ca ²⁺ / катионные антипортеры), которое сохраняется от бактерий до высших растений и животных (Pittman and Hirschi, 2016). Белки в суперсемействе CaCA обычно способствуют оттоку Ca ²⁺ против градиента концентрации через мембрану и способствуют притоку одновалентных катионов, таких как H ⁺ , Na ⁺ или K ⁺ в обмен (Amagaya et al. ., 2019). В зависимости от их функции и эволюционных взаимоотношений белки CaCA делятся на пять различных семейств: YRBG, Na ⁺ / Ca ²⁺ обменник (NCX), Na ⁺ / Ca ²⁺ , K ⁺ . обменник (NCKX), катион / Ca ²⁺ обменник (CCX) и H ⁺ / катионит (CAX) (Taneja et al., 2016; Amagaya et al., 2019; Mao et al., 2021) . Хотя эти белки имеют общий консервативный структурный домен Na_Ca_ex (PF01699), различные структурные и функциональные характеристики отличают их друг от друга.У высших растений существуют только подсемейства CAX и CCX с двумя дополнительными подгруппами MHX (Mg ²⁺ / H ⁺ обменник) и NCL (NCX-подобный) (Cai and Lytton, 2004).

Белки семейства CCX были идентифицированы у множества эукариотических организмов, включая простейшие, позвоночных, грибы и растения (Cai and Clapham, 2012; Emery et al., 2012). Обычно в наземных растениях содержится 3-6 белков CCX, в том числе восемь в Glycine max (Emery et al., 2012; Singh et al., 2014). Эти белки содержат две высококонсервативные области с α1 и α2-повторами. Однако филогенетический анализ классифицировал белки CCX на три подгруппы, что указывает на функциональную изменчивость белков семейства CCX. В Arabidopsis имеется пять белков CCX (Pittman, Hirschi, 2016). Доказано, что AtCCX1 представляет собой H ⁺ -зависимый обменник Na ⁺ / K ⁺ , расположенный на вакуолярной мембране дрожжей. Он увеличивает накопление Na ⁺ и уменьшает накопление K ⁺ в вакуоли AtCCX1, трансформированного Pitch pastoris GS115 (Chen et al., 2011). В Arabidopsis , гиперэкспрессия AtCCX1 ускоряла естественное и индуцированное H ₂ O ₂ старение в листьях, в то время как двойной мутант ccx1ccx4 демонстрировал фенотип «stay-green», опосредуя передачу сигналов Ca ²⁺ и реактивные формы кислорода. (ROS) гомеостаз (Li et al., 2016). AtCCX2 — это локализованный на мембране белок эндоплазматического ретикулума (ER), который регулирует как цитозольный, так и ER [Ca ²⁺ ], таким образом улучшая рост растений в условиях солевого стресса (Corso et al., 2018). Его гомологичный ген OsCCX2 в рисе подавляет чувствительность дрожжевого мутанта K667 к Ca ²⁺ . Штамм дрожжей K667, трансформированный OsCCX2 , также показал повышенную толерантность к избытку Na ⁺ , Li ⁺ , Fe ²⁺ , Zn ²⁺ и Co ²⁺ , что свидетельствует о его способности транспортировать как моно и двухвалентные катионы (Yadav et al., 2015). В другом исследовании было обнаружено, что OsCCX2 высоко экспрессируется в узлах риса.Как транспортер, расположенный на плазматической мембране, OsCCX2 транспортирует Cd ²⁺ из клетки и участвует в транслокации Cd ²⁺ от корня к побегу (Hao et al., 2018). AtCCX3 является локализованным в эндомембране H ⁺ -зависимым транспортером K ⁺ с очевидной транспортной активностью Na ⁺ и Mn ²⁺ (Morris et al., 2008). AtCCX4 может также подавлять дефектный фенотип дрожжевых мутантов в транспорте Na ⁺ , K ⁺ и Mn ²⁺ (Morris et al., 2008). Что касается AtCCX5, характеристика ионного транспорта этого белка у дрожжей показала, что он участвует в высокоаффинном захвате K ⁺ и транспорте Na ⁺ (Zhang et al., 2011).

Как экономически важное фруктовое дерево, яблоко ( Malus × domestica Borkh.) Является одним из наиболее широко выращиваемых видов в мире. На его производство влияют различные экологические стрессы, в том числе засуха, холод и засоление. Хотя белки CCX играют важную роль в регулировании устойчивости растений к солевому стрессу, до сих пор не сообщалось о подробных функциональных исследованиях белков семейства CCX в яблоке.Чтобы понять функцию белков CCX в регуляции солеустойчивости яблока, мы клонировали ген семейства CCX MdCCX1 из яблока. Основываясь на функциональной характеристике MdCCX1 трансгенных дрожжей, Arabidopsis , каллусов яблони и растений яблони, мы доказали, что MdCCX1 может повышать устойчивость растений к соли, ингибируя чрезмерное накопление Na ⁺ и способствуя элиминации АФК. Эти результаты закладывают основу для дальнейшего изучения механизма опосредованной CCX регуляции устойчивости растений яблони к солевому стрессу.

Материалы и методы

Растительные материалы, условия роста и средства лечения стресса

Сорт яблони «Гала» (GL-3) использовали для анализа экспрессии MdCCX1 при обработке NaCl. Отбирали одномесячные проростки с устойчивым состоянием роста и обрабатывали NaCl (200 мМ) в гидропонных условиях (25 ° C, постоянный белый свет) в питательном растворе Хогланда. Образцы, собранные в определенные моменты времени, были использованы для анализа относительного уровня экспрессии MdCCX1 .Выделение РНК и количественный анализ ОТ-ПЦР в реальном времени выполняли, как описано ранее (Mao et al., 2017). Ген малатдегидрогеназы ( MdMDH ) использовали в качестве эндогенного контроля, а относительный уровень экспрессии MdCCX1 был рассчитан с помощью метода 2 ^{— △△ CT} (Livak and Schmittgen, 2001). Для каждого эксперимента было выполнено три независимых биологических повтора и использовалось четыре технических повтора каждого биологического повтора.

Arabidopsis thaliana L.(Хейн), cv. Трансгенные семена поколения Columbia («Col») и T ₃ использовали для обработки NaCl. Стерилизованные на поверхности семена высевали на агаровую среду 1/2 MS, содержащую 0, 100, 150 и 200 мМ NaCl, а затем поместили при 4 ° C для яровизации. После двух дней культивирования на свету рассчитывали и сравнивали скорость прорастания семян. Сеянцы с полностью появившимися кончиками корешков (> 1 мм) оценивали по скорости прорастания семян. После вертикального культивирования на контрольной среде (1/2 МС) в течение 5 дней все линии, равномерно растущие, высевали на агаровую среду 1/2 МС с добавлением 0, 50, 100 и 150 мМ NaCl в течение 6 дней, а первичный Измеряли длину корней и сырую массу различных линий проростков Arabidopsis .Для фенотипического сравнения проростков Arabidopsis в условиях солевого стресса, четырехнедельные Arabidopsis с таким же состоянием роста были полностью орошены 0 или 200 мМ раствором NaCl каждые 5 дней в течение 15 дней в смеси питательной почвы и перлита. (1: 1, об / об). Каждый эксперимент состоит из трех независимых повторов, каждая из которых содержит не менее 24 растений.

Для солевой обработки каллусов 0,1 г порции каллусов дикого типа (WT) и трансгенных каллусов яблони с аналогичными состояниями роста культивировали на среде с добавлением 0, 100, 150 и 200 мМ NaCl в течение 15 дней.Каждая концентрация для обработки содержала три планшета в одной и 3 повторности всего.

Для эксперимента по обработке соли трансгенных растений яблони обработки были аналогичны таковым для Arabidopsis . Четырехнедельные проростки яблони поливали 0 или 150 мМ раствором NaCl в течение 7 дней.

Биоинформатический анализ MdCCX1

Белковые последовательности членов семейства CaCA из Arabidopsis были загружены из базы данных TAIR (информационный ресурс Arabidopsis).Филогенетическое дерево белков семейства MdCCX1 и CaCA из Arabidopsis было построено с помощью программного обеспечения MEGA 6.0 (версия 10.0.5; установка параметров: метод объединения соседей, метод начальной загрузки, 1000 повторов, модель Пуассона, попарная делеция). Прогнозирование консервативных доменов выполняли с использованием полноразмерных аминокислотных последовательностей MdCCX1 и AtCCX1 с использованием программ SMART и CD-Search соответственно.

Клонирование гена, конструирование вектора и генетическая трансформация MdCCX1

Суммарные РНК были выделены из листьев яблони Golden Delicious с использованием реагента Trizol (Thermo-Fisher Scientific) методом на основе CTAB.Синтез кДНК выполняли с помощью набора PrimeScript First-Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Далянь, Китай). Последовательность MD12G1011500 была загружена из базы данных GDR (База данных генома для Rosaceae), и специфичные для генов праймеры ( MdCCX1 -PMD-F и MdCCX1 -PMD-R) были разработаны на основе последовательности мРНК MD12G1011500 . Полноразмерную кодирующую последовательность MdCCX1 получали с помощью ОТ-ПЦР.

Для трансформации Arabidopsis полученный продукт ПЦР вставляли в вектор pBI121 под контролем промотора 35S с праймерами MdCCX1 -pBI121-F и MdCCX1 -pBI121-R.Клонированные векторы были генетически введены в «Col» Arabidopsis с помощью метода окунания цветков, опосредованного Agrobacterium tumefaciens GV3101 (Clough and Bent, 1998). После отбора канамицина, идентификации с помощью ПЦР и анализа qRT-PCR в последующих экспериментах использовали три гомозиготные трансгенные линии с высокой экспрессией MdCCX1 .

Каллусы

Apple (Orin) трансформировали вектором MdCCX1 -pBI121 с помощью метода Agrobacterium tumefaciens EHA105 (Li et al., 2012). После скрининга канамицина каллусные клетки, дифференцированные из разных положений (или из разных чашек) в культуральной среде, были отнесены к разным линиям и субкультивированы с 15-дневными интервалами. После 5 серийных пересевов устойчивые каллусы, демонстрирующие стабильный рост, были подвергнуты идентификации ПЦР трансгена и анализу qRT-PCR для определения уровня экспрессии MdCCX1 .

Для получения составных растений с генетически модифицированными корнями CDS MdCCX1 клонировали в вектор pCambia2300-GFP с праймерами MdCCX1 -2300GFP-F и -2300GFP-R и выбранным специфическим фрагментом длиной 300 п.н. MdCCX1 был клонирован в вектор РНКи pK7GWIWG2D, несущий GFP-метку для отбора трансформантов.Полученный вектор сверхэкспрессии pCambia2300- MdCCX1-GFP , вектор RNAi MdCCX1 -RNAi- GFP и два соответствующих пустых вектора были перенесены в Agrobacterium rhizogenes K599 для генетической трансформации корней яблони в соответствии с ранее описанным методом (Xiang et al., 2005; Hernandez-Piedra et al., 2020). Вкратце, культивированные через ткань проростки яблони в возрасте одного месяца срезали у основания стебля хирургическим лезвием, оставляя стебель длиной около 1,5 см для создания диагонального разреза.Стебель и верхушку погружали в суспензию К599 и вакуумировали при 0,08 МПа в течение 15 мин. После удаления избытка бактериальной жидкости проростки переносили в среду MS для дальнейшего культивирования. Когда эти проростки отрастили новые корни (около 1,5 месяцев), мы использовали конфокальный микроскоп с лазерным сканированием (TCS SP8 SR) для идентификации корней с флуоресценцией GFP. Анализ qRT-PCR идентифицировал относительный уровень экспрессии MdCCX1 в корнях этих растений.

Для трансформации дрожжевых мутантов CDS MdCCX1 амплифицировали с праймерами MdCCX1 -pDR196-F / R и клонировали в вектор pDR196.Рекомбинантный вектор MdCCX1 -pDR196 был трансформирован в следующие штаммы дрожжей с использованием метода ДНК-носителя LiAc / ss / ПЭГ (Gietz et al., 1995): Ca ²⁺ -чувствительный мутант дрожжей K667 (Δ cnb1 : LEU2 Δ pmc1 : TRP1 Δ vcx1 ) (Cunningham and Fink, 1996), который был чувствителен к высоким [Ca ²⁺ ], Na ⁺ -чувствительным мутантам дрожжей (Δ ena1-4 и Δ ena1-4 , Δ nha1 ), которые были чувствительны к высоким [Na ⁺ ], R5421 (MATα ura3-52 leu2 trk1 Δ his3 Δ 200 his4-15 trk2 Δ 1: pCK64 ), который был чувствителен к низким [K ⁺ ], и штаммам дрожжей дикого типа W301-1B (MATα leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15 ) и BY4741 (MATa his3 Δ 1 leu2 Δ 0 lys2 Δ 0 ura3 Δ 0 ).После селекции роста на селективной среде (синтетическая среда за вычетом соответствующих аминокислот) и подтверждения трансгена идентификацией ПЦР, для последующих экспериментов отбирали две отдельные колонии каждого штамма.

Последовательности всех праймеров, использованных в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице 1. Векторы были сконструированы с использованием метода бесшовного клонирования / клонирования методом слияния с использованием набора One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd), ферментной смеси Gateway BP Clonase II и смесь ферментов клоназы Gateway LR (Invitrogen Gateway) в соответствии с инструкциями производителя.

Идентификация ионно-транспортной функции MdCCX1 в дрожжах

Трансформанты дрожжей, экспрессирующие MdCCX1 -pDR196 или контрольный вектор, отбирали и культивировали в среде дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YPD) до OD ₆₀₀ = 0,6. Для анализа толерантности к ионам с различными штаммами дрожжей 1 мл дрожжевой культуры центрифугировали и трижды промывали стерильной водой, аликвоты по 10 мкл каждого 10-кратного серийного разведения (10 ⁰ , 10 ¹ , 10 ² , 10 ³ и 10 ⁴ ) были нанесены на пластины YPD с различными концентрациями CaCl ₂ , LiCl, MnCl ₂ , CdCl ₂ , BaCl ₂ , CuCl ₂ или MgCl ₂ , а затем инкубировали при 28 ° C в течение 3 дней.Трансформанты K667 и K667, экспрессирующие пустой вектор pDR196, использовали в качестве отрицательного контроля, а W303-1B использовали в качестве положительного контроля. Для обработок Na ⁺ два мутанта, чувствительных к Na ⁺ , служили отрицательными контролями. Для обработки K ⁺ положительные трансформанты R5421 были нанесены на чашки AP (№ K ⁺ ) с добавлением 0, 0,2, 0,5, 5 и 25 мМ KCl. Трансформанты R5421 и R5421, экспрессирующие пустой вектор pDR196, использовали в качестве отрицательного контроля, а штамм BY4741 использовали в качестве положительного контроля.

Для измерения скорости роста клеток дрожжевые клетки разбавляли до 0,1 при OD ₆₀₀ и затем культивировали в среде YPD с добавлением 200 мМ NaCl. Концентрацию измеряли в течение 8 часов с интервалом в 1 час.

Для определения содержания Na ⁺ в дрожжах исходную концентрацию положительных трансформантов BY4741 и контрольных штаммов доводили до 0,1. Дрожжевые клетки равного объема собирали и культивировали в жидкой среде YPD с добавлением 0, 100, 200 и 300 мМ NaCl до логарифмической фазы.Затем дрожжевые клетки собирали для определения содержания натрия.

Анализ субклеточной локализации MdCCX1

pCambia2300- MdCCX1-GFP и pCambia2300- AtCBL1-mCherry были введены в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101 соответственно. После идентификации с помощью ПЦР два трансгенных штамма Agrobacterium и штамм p19 (вспомогательный штамм) культивировали в течение ночи до OD ₆₀₀ = 0,6, собирали и корректировали OD ₆₀₀ = 1.5 с раствором для ресуспендирования (10 мМ MES, 10 мМ MgCl ₂ , 150 мкМ ацетосирингон, pH 5,8). Три бактериальных раствора смешивали в объемном соотношении 1: 1: 1 так, чтобы конечная концентрация каждого штамма была OD ₆₀₀ = 0,5. После инкубации при комнатной температуре в течение 2–4 ч смесь использовали для инфильтрации листьев 4–6-недельных растений табака ( Nicotiana benthamiana ) через шприц на 1 мл. Затем эти растения культивировали в течение 3 дней при фотопериоде 12 часов света / 12 часов темноты при 25 ° C для инкубации.AtCBL1 (AT4G17615) служил маркером, локализованным на плазматической мембране.

Выделение протопластов Arabidopsis и трансформацию проводили, как сообщалось ранее (Damm et al., 1989; Karesch et al., 1991). Вкратце, листья 4-7-й розетки Arabidopsis 4-недельного возраста переваривали в течение ночи смешанным раствором мацерозима R-10 (Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.) и целлюлозы R-10 (Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. .). Векторы pCambia2300- MdCCX1-GFP и pCambia2300- GFP были сконцентрированы этанолом, трансформированы в протопласты с помощью метода, опосредованного PEG-CaCl ₂ , и инкубированы в течение 18 часов при слабом освещении при 23 ° C.

Все флуоресцентные изображения были получены с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа (Leica TCS-SP8 SR). Сигналы флуоресценции GFP детектировались в диапазоне от 500 до 535 нм после возбуждения на 488 нм, в то время как mCherry возбуждали на 543 нм и сканировали на 600-630 нм.

Измерение физиологических параметров

Общее содержание хлорофилла и относительная утечка электролита (REL) были исследованы, как описано ранее, соответственно (Liang et al., 2017; Hang et al., 2020). Содержание малонового диальдегида (MDA) и активность CAT, POD и SOD измеряли в соответствии с инструкциями производителя с использованием наборов для обнаружения (Suzhou Comin Biotechnology Co., Ltd., Сучжоу, Китай). Для накопления АФК в растении листья покрывали 0,1% (мас. / Об.) DAB в течение 12 часов и 10 мМ фосфатным буфером (pH 7,8), содержащим 1 г / л NBT, в течение 4 часов при 28 ° C в темноте для обнаружения производство H ₂ O ₂ и O ₂ ^— путем гистохимического окрашивания соответственно. Хлорофилл удаляли из замоченных листьев 96% (об. / Об.) Этанолом (Zhou et al., 2019). H ₂ O ₂ и O ₂ ^— содержание определяли в соответствии с инструкциями наборов (Suzhou Comin Biotechnology Co., Ltd., Сучжоу, Китай). Чтобы продемонстрировать уровень накопления АФК в кончиках корней Arabidopsis , корни проростков инкубировали в 20 мкМ растворе C-h3DCFDA в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. После смывания избытка реагентов 0,9% -ным раствором NaCl были получены изображения зеленой флуоресценции с помощью конфокальной микроскопии (Neverisky and Abbott, 2015).

Флуоресценцию хлорофилла

после 30 мин адаптации к темноте измеряли с помощью Open FluorCam FC 800-O и анализировали с помощью программного обеспечения Fluorcam7 (PSI, Брно, Чешская Республика).Чистая скорость фотосинтеза регистрировалась портативной системой фотосинтеза (Li-6400; LICOR, Хантингтон-Бич, Калифорния, США) с 8:00 до 10:00 с фотонами 1000 мкм м ^–2 с ^–1. и постоянный расход воздуха 500 мкмоль⋅с ^–1 . В кювете концентрация CO ₂ устанавливалась равной 400 мкмоль CO ₂ моль ^–1 воздуха, с дефицитом давления пара 2,0–3,4 кПа.

Определение содержания Na

⁺ Концентрация

Растительный материал или дрожжевые клетки сушили при 105 ° C в течение 0.5 ч, а затем при 65 ° C в течение 3 дней. После измельчения в порошок 0,1 г каждого образца вываривали концентрированными растворами HNO ₃ и H ₂ O ₂ в течение 60 мин при 220 ° C с использованием муфельной печи. Согласно предыдущему методу концентрацию Na ⁺ измеряли с помощью пламенного фотометра (M410; Sherwood Scientific Ltd., Кембридж, Великобритания).

Статистический анализ

Программное обеспечение IBM SPSS (версия 26; IBM, Чикаго, Иллинойс, США) использовалось для сравнения различий с помощью одностороннего дисперсионного анализа, теста Дункана или теста Стьюдента t-.Различия между средними значениями считались значимыми, когда значение P P теста было меньше 0,05.

Результаты

Клонирование гена, анализ последовательности и паттерны экспрессии

MdCCX1

В нашем недавнем исследовании ген MD12G1011500 был идентифицирован как ортолог AtCCX1 у яблока (Mao et al., 2021). Специфичные для генов праймеры были разработаны на основе MD12G1011500 и использованы для амплификации полноразмерной кодирующей последовательности (CDS) MdCCX1 .Используя общую РНК, экстрагированную из листьев растений яблони Golden Delicious, в качестве матрицы, мы получили CDS MdCCX1 с помощью RT-PCR. Результаты секвенирования показали, что CDS MdCCX1 имеет длину 1746 п.н., кодирует белок из 581 аминокислоты, с прогнозируемой массой 63,27 кДа и pI 7,73. Чтобы исследовать филогенетические отношения между MdCCX1 и членами семейства CaCA в Arabidopsis , филогенетическое дерево было построено с использованием их белковых последовательностей (рис. 1A).MdCCX1 был сгруппирован в одной ветви с AtCCX1, что указывает на то, что MdCCX1 должен быть ортологом AtCCX1 в яблоке. Мы также идентифицировали консервативные домены, содержащиеся в AtCCX1 и MdCCX1, с помощью онлайн-программ CD-Search и SMART. Результаты показали, что MdCCX1 принадлежал к суперсемейству катион / кальций-обменник (суперсемейство PLN03151) и содержал два консервативных домена Na_Ca_ex, как и AtCCX1 (рис. 1B). Эти результаты дополнительно подтверждают, что клонированный MdCCX1 должен быть ортологом AtCCX1 в яблоке.

Рисунок 1. Анализ последовательности белка и идентификация экспрессии гена MdCCX1 . (A) Филогенетический анализ членов суперсемейства MdCCX1 и CaCA в Arabidopsis . Филогенетика была построена с помощью программного обеспечения MEGA-X. Масштабная линейка представляет 0,2 замены на сайт. (B) Консервативные домены, идентифицированные в белках AtCCX1 и MdCCX1 с использованием онлайн-базы данных SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) и инструмента CD-Search (https: // www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi). (C) Относительные уровни экспрессии MdCCX1 в различных тканях яблока. (D) Относительные уровни экспрессии MdCCX1 в корнях в ответ на обработку 200 мМ NaCl. Относительные уровни экспрессии MdCCX1 были рассчитаны по отношению к контрольным образцам (корень в C и 0 ч в D) методом 2 ^–ΔΔCT . MdMDH служил эталонным геном. Различные буквы обозначают значительные различия (односторонний дисперсионный анализ ANOVA и тест Дункана: p <0.05). Регистрационный номер: AtCCX1 (AT5G17860.1), AtCCX2 (AT5G17850.1), AtCCX3 (AT3G14070.1), AtCCX4 (AT1G54115.1), AtCCX5 (AT1G08960.1), AtCAX1 (AT2G38170.3), AtCAX320.1 (AT3G320.1) ), AtCAX3 (AT3G51860.1), AtCAX4 (AT5G01490.1), AtCAX5 (AT1G55730.1), AtCAX6 (AT1G55720.1), AtMHX1 (AT2G47600.1), AtNCL (AT1G53210.1), MdCCX1 (MD12G1011500).

Суммарная РНК корней, стеблей, листьев, цветов и плодов растений яблони «GL-3» была экстрагирована и использована для анализа qRT-PCR для исследования характера экспрессии MdCCX1 в различных тканях яблока.Уровень экспрессии MdCCX1 был наивысшим в листе, за ним следуют корень и стебель, с самыми низкими уровнями в цветках и плодах (рис. 1С). Предыдущие исследования показали, что гены семейства CCX участвуют в регуляции солеустойчивости. Для изучения реакции MdCCX1 на солевой стресс проростки «GL-3» обрабатывали 200 мМ NaCl с использованием гидропонной системы. Корни проростков собирали после различных временных точек обработки солью и использовали для экстракции РНК и анализа экспрессии qRT-PCR.Результаты показали, что экспрессия MdCCX1 непрерывно увеличивалась и достигла пика через 3 часа обработки солью. Впоследствии, хотя уровень экспрессии MdCCX1 продолжал снижаться, его уровень экспрессии в конце лечения все еще был значительно выше (2,5x), чем в 0 ч (рис. 1D). Этот результат доказал, что MdCCX1 значительно реагировал на солевой стресс, особенно на ранней стадии стрессовой реакции, что указывает на его роль в регуляции реакции солевого стресса.

Субклеточная локализация белка MdCCX1

Субклеточная локализация переносчиков ионов, таких как белки CCX, играет решающую роль в переносе ионов и регуляции реакции на стресс. CDS MdCCX1 клонировали в вектор pCambina2300-GFP для определения субклеточной локализации MdCCX1. AtCBL1, слитый с тегом mCherry, использовали в качестве маркера клеточной мембраны. Затем конструкции 35S: MdCCX1-GFP и 35S: AtCBL1-mCherry трансформировали в эпидермальные клетки листьев табака ( Nicotiana benthamiana ) с помощью метода мгновенной экспрессии, опосредованного Agrobacterium .Через 3 дня культивирования флуоресценцию GFP в клетках листьев табака наблюдали под флуоресцентным микроскопом. Когда контрольный вектор GFP был экспрессирован, флуоресценцию GFP можно было наблюдать повсеместно по всей клетке. Однако в клетках, экспрессирующих MdCCX1-GFP, сигнал зеленой флуоресценции был локализован на клеточной мембране и колокализован с сигналом красной флуоресценции AtCBL1-mCherry (рис. 2А). Для дальнейшего подтверждения субклеточной локализации MdCCX1 в растениях мы также экспрессировали контрольный вектор GFP и конструкцию 35S: MdCCX1-GFP в протопластах Arabidopsis .Зеленый сигнал флуоресценции контроля GFP был распределен повсеместно по протопласту, тогда как слитый белок MdCCX1-GFP можно было наблюдать только на плазматической мембране протопластной клетки (рис. 2B). Эти результаты позволяют предположить, что MdCCX1 локализован на плазматической мембране растительных клеток.

Рисунок 2. Субклеточная локализация белка MdCCX1. (A) Флуоресценция слитого белка MdCCX1-GFP в эпидермальных клетках табака. Слитый белок AtCBL1-mCherry служил маркером, локализованным на плазматической мембране. (B) Флуоресценция слитого белка MdCCX1-GFP в протопластах Arabidopsis . Пустой вектор pCambia2300-GFP использовали для экспрессии белка GFP в качестве контроля. Показаны флуоресценция, светлое поле и объединенные изображения репрезентативных клеток. Масштабные линейки 30 мкм в эпидермальных клетках табака; 10 мкм в протопластах Arabidopsis .

Анализ характеристик ионного транспорта MdCCX1 в дрожжевых мутантах, чувствительных к кальцию и натрию

Дрожжевые мутанты, чувствительные к определенным ионам, обеспечивают удобство изучения характеристик ионного транспорта различных переносчиков.Штамм дрожжей K667, чувствительный к высокому уровню [Ca ²⁺ ], часто используется для идентификации транспорта Ca ²⁺ , характерного для белков суперсемейства CaCA. Чтобы проверить, может ли белок MdCCX1 транспортировать Ca ²⁺ , полноразмерный CDS MdCCX1 клонировали в вектор экспрессии дрожжей pDR196 для генетической трансформации K667. Дрожжевой мутант K667 и положительные трансформанты пустого вектора pDR196 использовали в качестве отрицательного контроля. Эти штаммы дрожжей были последовательно разведены и культивированы в среде YPD, дополненной различными концентрациями CaCl ₂ для сравнения роста.К нашему удивлению, рост штаммов дрожжей, трансформированных MdCCX1 , не показал заметных различий по сравнению с отрицательными контролями (рис. 3А). Этот результат предполагает, что MdCCX1 не обладает способностью к переносу ионов кальция, которая отличается от белков CCX в Arabidopsis и рисе. Помимо Ca ²⁺ , исследования на рисе показали, что OsCCX2 может также переносить различные одновалентные и двухвалентные ионы. Таким образом, мы дополнительно проверили, может ли MdCCX1 переносить другие ионы, содержащие Li ⁺ , Mn ²⁺ , Cd ²⁺ , Ba ²⁺ , Cu ²⁺ и Mg ²⁺ , используя K667 напряжение.К сожалению, сверхэкспрессия MdCCX1 не усиливала толерантность трансгенных штаммов дрожжей к этим ионам, предполагая, что MdCCX1 также не должен быть способен транспортировать эти ионы (дополнительный рисунок 1A).

Рисунок 3. Эксперименты по функциональной комплементарности MdCCX1 в дрожжевых мутантах. (A) Идентификация транспортных характеристик Ca ²⁺ MdCCX1 в K667. Тройной мутант дрожжей K667 (Δpmc1Δvcx1Δcnb1) трансформировали пустым вектором pDR196 или pDR196- MdCCX1 .Аликвоты по 10 мкл серийных разведений (10, 10 ² , 10 ³ и 10 ⁴ ) наносили точечно на среду YPD в присутствии 0, 50, 75, 100, 125 мМ CaCl ₂ и выросла за 3 дн. W303-1B был положительным контролем. (B) и (C) Na ⁺ толерантность дрожжевых клеток, экспрессирующих pDR196- MdCCX1 или pDR196 в Δ ena1-4 (B) или Δ ena1-4 , Δ nha1 (C) мутанты дрожжей. После градиентного разведения положительных трансформантов и контрольных линий дрожжей аликвоты по 10 мкл серийных разведений (10, 10 ² , 10 ³ и 10 ⁴ ) наносили точечно на среду YPD, дополненную различными концентрациями NaCl. и выращивали 3 дн. (D) и (E) Кривые роста штаммов дрожжей в (C) и (D) при обработке 200 мМ NaCl с начальной концентрацией OD 600 = 0,1. (F) Содержание натрия в дрожжевых клетках. Дрожжи дикого типа BY4741 трансформировали pDR196- MdCCX1 или pDR196. Все штаммы дрожжей, выращенные в среде YPD с добавлением 0, 100, 200 или 300 мМ NaCl до логарифмической фазы роста, собирали для определения Na ⁺ . Данные представляют собой средние значения трех независимых экспериментов и представлены как среднее ± стандартное отклонение.Значимые различия (*) относительно пустого вектора и BY4741 определяли с использованием t-критерия Стьюдента : p <0,05.

Чтобы выяснить, обладает ли MdCCX1 транспортной способностью Na ⁺ , два штамма чувствительных к натрию дрожжевых мутантов, мутант Δ ena1-4 , который потерял Na ⁺ -АТФазу на клеточной мембране, и Δ ena1- 4 , Δ nha1 , который потерял обменник Na ⁺ -АТФаза и Na ⁺ / H ⁺ на клеточной мембране.Сначала мы сверхэкспрессировали MdCCX1 в мутантном штамме дрожжей Δ ena1-4 , используя pDR196 в качестве отрицательного контроля. В условиях среды YPD (без NaCl) не было разницы в росте между MdCCX1 -трансформированными и контрольными штаммами pDR196. Однако при высокой концентрации NaCl рост всех штаммов был значительно подавлен, а эффект подавления контрольных штаммов был более значительным, особенно при 200, 300 и 400 мМ NaCl (рис. 3B).Сходные результаты были обнаружены в двойном мутантном штамме дрожжей Δ ena1-4 , Δ nha1 (рис. 3С). Чтобы дополнительно подтвердить эти результаты, мы измерили скорость роста этих штаммов, культивированных в жидкой среде YPD с добавлением 200 мМ NaCl. Результаты показали, что скорость роста трансформантов, сверхэкспрессирующих MdCCX1 , была значительно выше, чем у контрольных штаммов pDR196 (рисунки 3D, E), что позволяет предположить, что сверхэкспрессия MdCCX1- усиливала солевую толерантность трансгенных штаммов дрожжей.Это могло быть связано с восстановлением потери функции оттока натрия у двух мутантов дрожжей.

Отсутствующий ген ENA в этих чувствительных к натрию мутантах дрожжей кодирует АТФазу P-типа, ответственную за экскрецию Na ⁺ и селективную абсорбцию K ⁺ . Чтобы исключить эффект K ⁺ , использовали мутант дрожжей R5421, чувствительный к низкому [K ⁺ ] (дефицит абсорбции K ⁺ ), чтобы определить, может ли белок MdCCX1 способствовать абсорбции K ⁺ .Мы трансформировали вектор emptor MdCCX1 -pDR196 и pDR196 в штамм R5421 соответственно. Затем трансгенные штаммы культивировали на среде AP (без калия) с различными концентрациями KCl. Результаты показали, что сверхэкспрессия MdCCX1 не могла подавить чувствительность к низкой концентрации K ⁺ R5421, предполагая, что MdCCX1 не обладал абсорбционной способностью K ⁺ (дополнительная фигура 1B).

Чтобы определить, может ли MdCCX1 способствовать оттоку Na ⁺ в дрожжевые клетки, MdCCX1 трансформировали в дрожжевой штамм BY4741.Трансформанты инкубировали в жидкой среде YPD, содержащей 0, 100, 200 и 300 мМ NaCl, до тех пор, пока значение OD ₆₀₀ не достигло 0,6. Затем дрожжевые клетки собирали для определения содержания Na ⁺ . Как показано на фиг. 3F, содержание Na ⁺ в MdCCX1 -сверхэкспрессирующих дрожжевых клетках было значительно ниже, чем у контрольных штаммов, что позволяет предположить, что MdCCX1 должен обладать активностью оттока Na ⁺ .

Эктопическая экспрессия

MdCCX1 способствует прорастанию семян и повышенной толерантности к соли у трансгенных животных Arabidopsis

Чтобы исследовать роль MdCCX1 в регуляции солеустойчивости растений, он был эктопически экспрессирован в Arabidopsis .Посредством отбора устойчивости к канамицину, идентификации ПЦР и анализа экспрессии MdCCX1 (дополнительные рисунки 2A, B) семена поколения T ₃ трех репрезентативных линий с высокими уровнями экспрессии MdCCX1 (OE-1, OE-2, OE -3) были выбраны для последующей обработки солью и фенотипического анализа. Сначала мы измерили скорость прорастания семян этих трансгенных линий и Col. Семена яровировали в течение 3 дней при 4 ° C, а затем высевали в среду 1/2 MS, содержащую 0, 50, 100 и 150 мМ NaCl.Через 2 дня культивирования подсчитывали всхожесть каждой линии. Линии со сверхэкспрессией Col и MdCCX1- на среде 1/2 MS не показали значительных различий в прорастании, при этом скорость прорастания всех линий близка к 100% (фиг. 4). Добавление NaCl снижало скорость прорастания семян всех линий, но у линий со сверхэкспрессией MdCCX1- было значительно выше, чем у линий Col (рис. 4), что свидетельствует о том, что сверхэкспрессия MdCCX1 уменьшала эффект ингибирования солевого стресса на прорастание семян. .

Рисунок 4. Анализ скорости прорастания семян «Col» и MdCCX1 трансгенных линий с избыточной экспрессией в условиях стресса NaCl. (A) Типичное изображение всхожести. T ₃ семян от MdCCX1 -сверхэкспрессирующих линий диспергировали в среде 1/2 MS, содержащей различные концентрации NaCl (0, 100, 150 и 200 мМ), в течение 2 дней. (B) Статистика проросших семян в (A) . Данные представляют собой средние значения трех независимых экспериментов и представлены как среднее ± стандартное отклонение.Значимые различия (*) относительно «Col» были определены с использованием t-критерия Стьюдента : p <0,05.

Затем мы изучили влияние солевого стресса на рост проростков арабидопсиса . Пятидневные проростки Arabidopsis помещали вертикально на среду 1/2 MS с добавлением 0, 50, 100 и 150 мМ NaCl и культивировали в условиях длинного дня в течение 6 дней. В нормальной среде 1/2 MS не было заметной разницы по длине корня и сырой массе между трансгенными линиями MdCCX1 и проростками Col.Однако при обработке NaCl длина корней этих трансгенных линий MdCCX1 была значительно больше, а свежий вес был значительно выше, чем у проростков Col (Фигуры 5A – C). Солевой стресс может вызвать чрезмерное накопление АФК, что приведет к окислительному повреждению тканей растений. Здесь флуоресцентный краситель C-h3DCFDA был использован для визуализации накопления АФК в корнях проростков. В нормальных условиях линии OE и Col показали слабые сигналы флуоресценции в кончиках корней, что указывает на низкий уровень накопления ROS.При концентрации NaCl 100 мМ флуоресценция кончиков корней всех линий была сильнее, чем у контрольной группы, в то время как флуоресценция трансгенных линий MdCCX1 была значительно слабее, чем у проростков Col, что указывает на то, что проростки Col накапливали больше АФК в корнях под воздействием соли. стресс (рис. 5D). Эти результаты предполагают, что сверхэкспрессия MdCCX1 усиливает солеустойчивость трансгенных проростков Arabidopsis .

Рисунок 5. Фенотипическое сравнение «Col» и MdCCX1 -сверхэкспрессирующих трансгенных проростков Arabidopsis при стрессе NaCl. (A) Репрезентативные изображения пятидневных «Col» и трансгенных проростков культивировали в течение 6 дней на среде 1/2 MS с добавлением 0, 50, 100 и 150 мМ NaCl. Прутки = 1 см. Длина корня (B) и масса в сыром виде (C) всего сеянца в (A) . Планки погрешностей представляют стандартное отклонение на основе 3 независимых повторов. (D) Накопление ROS в кончиках корней, обработанных 100 мМ NaCl в (A) . Корни метили чувствительным к АФК флуоресцентным зондом C-h3DCFDH.Представлены яркое и флуоресцентное поля. Шкала 100 мкм. Для (B, C) столбцы, помеченные знаком * на каждой панели, указывают значения, которые значительно отличаются от «Col» при p <0,05, с использованием t-критерия Стьюдента .

Мы дополнительно исследовали регуляторную функцию MdCCX1 в отношении солеустойчивости с использованием однолетних взрослых растений Arabidopsis , выращенных в почве. В нормальных условиях не было заметных морфологических различий между трансгенными линиями и растениями Col.Однако после 14 дней обработки NaCl большинство листьев растений Col пожелтели, увяли или даже погибли, что указывает на то, что эти растения серьезно пострадали от стресса. Однако большинство листьев трансгенных растений MdCCX1 оставались зелеными и энергичными, и только края некоторых листьев демонстрировали фенотип пожелтения (рис. 6А). Измерения связанных со стрессом физиологических показателей, таких как содержание хлорофилла, относительная утечка электролитов (REL) и уровни MDA, также подтверждают фенотипические различия.В нормальных условиях не было значимой разницы в физиологических показателях между трансгенными линиями MdCCX1 и контрольными растениями. Однако при солевой обработке содержание хлорофилла было значительно выше, а содержание REL и MDA было значительно ниже в трансгенных линиях MdCCX1 , чем в контрольных растениях (Рисунки 6B – D). Эти результаты показали, что сверхэкспрессия MdCCX1 усиливала солеустойчивость трансгенных растений Arabidopsis .

Рис. 6. Оценка солеустойчивости у трансгенных растений Arabidopsis с избыточной экспрессией MdCCX1 и MdCCX1 . (A) Типичные изображения «Col» и трансгенных растений, подвергнутых воздействию 200 мМ NaCl в течение 15 дней. Масштабные линейки 4 см. Общее содержание хлорофилла (B) , относительная утечка электролита (C) , содержание MDA (D) и содержание Na ⁺ (E) всех линий проростков, измеренные после обработки NaCl. (F) Ферментативная активность антиоксидантных ферментов CAT, POD и SOD, измеренная после обработки NaCl. (G) Относительные уровни экспрессии AtCAT1 , AtPOD ​​ и AtSOD1 . AtActin служил эталонным геном. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение на основе 3 независимых повторов. Для (B – G) столбцы, помеченные знаком * на каждой панели, указывают значения, которые значительно отличаются от «Col» при p <0,05, с использованием t-критерия Стьюдента .

Переносчики ионов могут повысить толерантность растений к соли, удаляя лишний Na ⁺ из клетки или разделяя их на вакуоли для предотвращения токсичности Na ⁺ . Основываясь на функции MdCCX1 в стимулировании оттока Na ⁺ в дрожжевые клетки (рис. 3), мы измерили содержание Na ⁺ в этих обработанных NaCl растениях Arabidopsis . В нормальных условиях все растения содержались при базальном содержании Na ⁺ (∼15.1 мг / г DW), без разницы между разными линиями. Однако после обработки NaCl содержание Na ⁺ в трех трансгенных линиях было значительно ниже, чем в контрольных растениях (фиг. 6E). Этот результат показал, что сверхэкспрессия MdCCX1 усиливала солеустойчивость трансгенных растений за счет ингибирования избыточного накопления Na ⁺ в условиях солевого стресса.

Чрезмерное накопление АФК в результате стресса вредно для растений. Антиоксидантные ферменты, такие как каталаза (CAT), пероксидаза (POD) и супероксиддисмутаза (SOD), являются ключевыми ферментами для удаления ROS.Таким образом, была изучена активность этих трех антиоксидантных ферментов. В контрольных условиях ферментативная активность CAT, POD и SOD была одинаковой у всех растений. Однако трансгенные проростки показали более сильную активность антиоксидантных ферментов, чем растения Col при солевом стрессе (фиг. 6F), что позволяет предположить, что сверхэкспрессия MdCCX1 увеличивала активность антиоксидантных ферментов в ответ на обработку соли. Для дальнейшего изучения того, как сверхэкспрессия MdCCX1 увеличивает активность этих антиоксидантных ферментов, исследовали уровни экспрессии генов, кодирующих эти ферменты.В соответствии с активностью фермента, уровни экспрессии AtCAT1 , AtPOD ​​ и AtSOD1 также были значительно выше у трансгенных растений MdCCX1 в условиях солевого стресса (рис. 6G). Эти результаты показали, что помимо ингибирования накопления Na ⁺ , MdCCX1 также может повышать толерантность растений к соли, стимулируя активность антиоксидантных ферментов.

Сверхэкспрессия

MdCCX1 Повышенная толерантность к соли трансгенных каллусов яблони

MdCCX1 -pBI121-трансформированные каллусы яблока использовали для определения функции MdCCX1 в регуляции солеустойчивости яблока.Посредством ПЦР-идентификации и анализа экспрессии были отобраны три независимые трансгенные линии с высокими уровнями экспрессии MdCCX1 (дополнительные рисунки 2C, D). MdCCX1 трансгенных каллусов и каллусов дикого типа яблони (WT) выращивали на среде MS, дополненной различными концентрациями NaCl (0, 100, 150 и 200 мМ). После 15 дней культивирования на нормальной среде MS не было значительных различий в росте между MdCCX1 -трансгенными линиями с повышенной экспрессией и WT (фигура 7A).NaCl подавлял рост WT и трансгенных линий, но скорость роста трансгенных линий была значительно выше, чем у WT (фиг. 7A). В соответствии с фенотипическим феноменом, свежий вес трансгенных линий также был значительно выше, чем у WT (фигура 7B). Эти результаты предполагают, что сверхэкспрессия MdCCX1 снижает эффект ингибирования солевого стресса на рост каллусов яблони.

Рис. 7. Влияние обработки NaCl на рост трансгенных каллусов яблони, гиперэкспрессирующих MdCCX1 и MdCCX1.Репрезентативные изображения (A) , свежий вес (B) , содержание Na ⁺ (C) и активность антиоксидантных ферментов (D – F) в каллусах дикого и трансгенного яблонь. Каллусы яблони культивировали на среде MS с добавлением 0, 100, 150 и 200 мМ NaCl в течение 15 дней. Масштабные линейки 1 см. Для (B – F) столбцы, помеченные * на каждой панели, указывают значения, которые значительно отличаются от WT при p <0,05, с использованием t-критерия Стьюдента .

Мы измерили содержание Na ⁺ в каллусах яблони, культивируемых в нормальных условиях и в условиях, обработанных солью. С увеличением концентрации NaCl содержание Na ⁺ во всех линиях каллусов яблони увеличивалось, но содержание Na ⁺ в трансгенных каллусах с избыточной экспрессией MdCCX1 было значительно ниже, чем у WT (рис. 7C). Это предполагает, что MdCCX1 может повышать солеустойчивость каллусов яблони путем ингибирования накопления Na ⁺ .Поскольку сверхэкспрессия MdCCX1 могла улучшить активность антиоксидантных ферментов в трансгенном Arabidopsis при солевом стрессе (рис. 6F), мы дополнительно исследовали влияние MdCCX1 на активность антиоксидантного фермента в каллусах яблони. Как мы и ожидали, при солевом стрессе активность антиоксидантного фермента в трансгенных каллусах MdCCX1 была значительно выше, чем у каллусов дикого типа (Рисунки 7D – F), указывая тем самым, что MdCCX1 может улучшать солевую толерантность каллусов яблони, способствуя активности антиоксидантных ферментов.

Agrobacterium rhizogenes — Опосредованная трансформация MdCCX1 в корнях яблони, пораженная солеустойчивостью растений яблони

A. rhizogenes , почвенный патоген, который вызывает придаточные генетически трансформированные корни, используется для получения трансгенных корней. A. rhizogenes приводит к получению так называемых «сложных растений», включающих трансгенную волосатую корневую систему, прикрепленную к нетрансформированным побегам. Поскольку мы еще не получили стабильные трансгенные растения яблони, в которых MdCCX1 сверхэкспрессируется или нарушается, этот подход облегчает быстрое изучение его функции в регуляции солеустойчивости в яблоках.Сначала кодирующая область и специфический ингибирующий фрагмент MdCCX1 были клонированы в векторы pCambia2300-GFP и pK7GWIWG2D-GFP соответственно. Затем растения яблони с трансгенными волосатыми корнями были получены из «GL-3» с помощью метода трансформации, опосредованной A. rhizogenes K599. Флуоресценция GFP показала, что векторы успешно экспрессировались в корнях (рис. 8А). Анализ экспрессии показал, что MdCCX1 был усилен в корнях MdCCX1 -сверхэкспрессирующих (OE) линий, но заметно подавлен в линиях РНКи по сравнению с пустыми векторными контролями (фиг. 8B).Не наблюдали значительных различий в экспрессии MdCCX1 между линиями контроля пустых векторов (OE-EV и RNAi-EV) и WT (фиг. 8B).

Рисунок 8. Фенотипический анализ трансгенных растений яблони при обработке 150 мМ NaCl. (A) Типичные изображения флуоресценции GFP трансгенных корней яблони. OE-EV и RNAi-EV представляют собой корни, трансформированные пустым вектором pCambia2300 или pK7GWIWG2D. Масштабные линейки 300 мкм. (B) Идентификация экспрессии MdCCX1 в трансгенных корнях яблони. (C) Типичные изображения фенотипов, обработанных 0 или 150 мМ NaCl в течение 7 дней. Масштабные линейки 4 см. (D) Относительная утечка электролита. (E) Содержание MDA. Репрезентативные изображения флуоресценции хлорофилла (F) и отношения Fv / Fm (G) различных трансгенных линий в нормальных условиях и стрессовых условиях NaCl. Ложные цвета на изображениях указывают на отношения Fv / Fm в диапазоне от 0 (черный) до 1,0 (красный). (H) Чистая скорость фотосинтеза (Pn). Значения каждого индекса представляют собой средние значения для всех линий трансгенных растений одного типа для (D), , (E), , (G), и (H), .Значения являются средними для 20 повторов ± стандартное отклонение. * на каждой панели указывает значения, которые значительно отличаются от соответствующих контрольных линий при p <0,05, с использованием t-критерия Стьюдента .

Затем

растений яблони полностью орошали 0 (контрольная группа) или 150 мМ раствором NaCl для обработки соли. В нормальных условиях достоверных различий между разными трансгенными линиями не было. Однако после 7 дней обработки солью растения MdCCX1-OE показали лучшее состояние роста, чем линии (OE) -EV, с их листьями, оставшимися ярко-зелеными и энергичными.Напротив, подавление экспрессии MdCCX1 приводило к тому, что растения яблони росли хуже, чем линии (RNAi) -EV, с появлением большего количества коричневых пятен и участков на их листьях (фигура 8C). Результаты гистологического окрашивания листьев DAB и NBT также показали высокий уровень накопления H ₂ O ₂ и O ₂ ^— (дополнительный рисунок 3). Мы также измерили связанные со стрессом физиологические показатели содержания REL и MDA в листьях этих растений, чтобы оценить ущерб, нанесенный солевой обработкой.При солевом стрессе содержание REL и MDA было значительно ниже в листьях растений MdCCX1-OE, но значительно выше у растений MdCCX1-RNAi (Фигуры 8D, E). Эти результаты свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия MdCCX1 в корнях значительно повышает солеустойчивость растений яблони.

Флуоресценция хлорофилла — подходящий инструмент для раннего определения степени повреждения растений. Максимальная фотохимическая эффективность ФС II в темноте (Fv / Fm) была важным показателем параметров флуоресценции хлорофилла, поэтому мы измерили флуоресценцию каждой линии как в контрольной, так и в группе обработки NaCl.Отношения Fv / Fm всех линий в контрольной группе были аналогичными и поддерживались на высоком уровне (Рисунки 8F, G). Однако при солевой обработке отношения Fv / Fm линий MdCCX1-OE были значительно выше, чем у двух контрольных линий, тогда как соотношение линий MdCCX1-RNAi было значительно ниже, чем у контрольных линий (Фигуры 8F, G). Повреждение фотосинтетических единиц напрямую влияет на фотосинтез. Таким образом, мы дополнительно измерили чистую скорость фотосинтеза (Pn) этих растений. Результаты показали, что эффективность Pn в этих растениях соответствовала таковой для Fv / Fm (фигура 8H).Эти результаты также подтверждают, что сверхэкспрессия MdCCX1 в корнях усиливает солеустойчивость растений яблони.

MdCCX1 -Сверхэкспрессия Повышенная толерантность к соли растений яблони путем ингибирования чрезмерного накопления Na ⁺ и активных форм кислорода

Чтобы исследовать механизм MdCCX1 в повышении солеустойчивости яблоневых растений, мы далее сосредотачиваемся на эффекте сверхэкспрессии MdCCX1 в корнях, как первом органе растения, на который влияет засоление почвы.Измерение активности корней не показало различий между трансгенными линиями MdCCX1 и контрольными линиями при нормальных условиях. После солевой обработки жизнеспособность корней линий MdCCX1-OE была значительно выше, тогда как жизнеспособность корней линий MdCCX1-RNAi была значительно ниже, чем у контрольных линий (фигура 9A). Это указывает на то, что сверхэкспрессия MdCCX1 облегчает повреждение корней яблони, вызванное солевым стрессом. Основываясь на функции MdCCX1 в ингибировании накопления Na ⁺ в дрожжах и растениях, мы измерили содержание Na ⁺ в этих растениях яблони.Как мы и ожидали, содержание Na ⁺ в корнях линий MdCCX1-OE было значительно ниже, чем в контроле после обработки солью, а линии MdCCX1-RNAi показали противоположные результаты (фигура 9B). Более того, содержание Na ⁺ в листьях этих растений также показало тот же результат, предполагая, что сверхэкспрессия MdCCX1 в корнях яблони также может снижать накопление Na ⁺ в листьях при солевом стрессе (рис. 9C). Эти результаты предполагают, что сверхэкспрессия MdCCX1 может повышать солеустойчивость растений яблони путем ингибирования избыточного накопления Na ⁺ .

Рисунок 9. MdCCX1 регулирует накопление Na ⁺ и активность антиоксидантных ферментов. (A) Жизнеспособность корней. (B) Содержание Na ⁺ в корнях. (C) Содержание Na ⁺ в листьях. Содержание пероксида водорода (H ₂ O ₂ ) (D) и содержания супероксид-аниона (O ₂ ^— ) (E) в корнях трансгенных яблонь. (F – H) Ферментативная активность антиоксидантных ферментов CAT (F) , POD (G) и SOD (H) в нормальных условиях и стрессовых условиях NaCl.Значения каждого индекса представляют собой средние значения всех линий трансгенных растений одного типа. Значения являются средними для 20 повторов ± стандартное отклонение. * на каждой панели указывает значения, которые значительно отличаются от соответствующих контрольных линий при p <0,05, с использованием t-критерия Стьюдента .

Для дальнейшего изучения функции MdCCX1 в стимулировании поглощения АФК у растений яблони в условиях солевого стресса мы измерили накопление АФК и активность антиоксидантных ферментов в корнях этих растений.В нормальных условиях разницы между разными линиями яблонь не было. При солевом стрессе содержание H ₂ O ₂ и O ₂ ^— было значительно ниже (рисунки 9D, E), но активность антиоксидантных ферментов (CAT, POD, SOD) была значительно выше в корнях. линий MdCCX1-OE. Противоположная тенденция наблюдалась в линиях MdCCX1-RNAi (Рисунки 9F-H). Эти результаты показали, что сверхэкспрессия MdCCX1 способствовала элиминации ROS при солевом стрессе, тем самым уменьшая стрессовое повреждение, вызванное чрезмерным накоплением ROS.В целом, MdCCX1 играет положительную роль в устойчивости растений яблони к соли, ингибируя чрезмерное накопление Na ⁺ и АФК при солевом стрессе.

Обсуждение

Абиотический стресс, возникающий в результате чрезмерного засоления, имеет разрушительные последствия для роста, развития и урожайности растений. С развитием биотехнологии стало зрелым и быстрым способом использовать трансгенный метод для выращивания устойчивых культур, который зависит от функциональных характеристик генов, связанных со стрессом.На сегодняшний день некоторые работы показали, что CCX играют жизненно важную роль в реакциях на абиотический стресс. Однако подробных функциональных исследований белков семейства CCX в яблоке не сообщалось. Здесь мы клонировали ген MdCCX1 из яблока и идентифицировали его функцию в регуляции солеустойчивости с использованием трансгенных растений Arabidopsis и яблони. Эти результаты, в сочетании с субклеточной локализацией MdCCX1 и его функцией по ингибированию накопления Na ⁺ , позволяют нам заключить, что MdCCX1 действует как расположенный на плазматической мембране переносчик оттока Na ⁺ для повышения устойчивости растений к соли.

Субклеточная локализация играет жизненно важную роль в функции переносчиков ионов

Субклеточная локализация была одной из основных характеристик переносчиков ионов, которая может напрямую влиять на их функцию. Расположенные на мембране клетки Arabidopsis антипотеры Na ⁺ / H ⁺ , такие как SOS1, уменьшают [Na ⁺ ] _cyto путем вытеснения Na ⁺ из цитоплазмы (Shi et al., 2000 ; Song et al., 2012). С другой стороны, антипортеры Na ⁺ / H ⁺ на тонопласте (например,g., AtNHX1) разделяют Na ⁺ в вакуоль, чтобы восстановить [Na ⁺ ] _cyto (Sottosanto et al., 2007; Asif et al., 2011; Kumar et al., 2017). Сверхэкспрессия любого из этих двух видов антипортеров Na ⁺ / H ⁺ может усиливать солеустойчивость трансгенных растений. Что касается белков CCX, AtCCX2 расположен на мембране ER и регулирует солеустойчивость растений, поддерживая гомеостаз Ca ²⁺ и Na ⁺ (Corso et al., 2018). AtCCX1 располагается на тонопласте в дрожжевых клетках и увеличивает накопление Na ⁺ в дрожжевой вакуоли, что позволяет предположить, что он может быть транспортером Na ⁺ , расположенным в тонопласте (Chen et al., 2011), но экспериментальные доказательства на растениях отсутствуют. Исследования белков семейства CaCA обнаружили белки, которые обнаруживают различную локализацию в клетках дрожжей и растений, такие как AtNCL (Wang et al., 2012). Было доказано, что у риса OsCCX2 расположен на плазматической мембране и опосредует отток Cd ²⁺ , повышая толерантность к Cd ²⁺ (Hao et al., 2018). Эти исследования указывают на разные паттерны субклеточной локализации и ионную транспортную активность разных белков семейства CCX у разных видов растений.Из-за этого мы сначала исследовали субклеточную локализацию MdCCX1, прежде чем идентифицировать его характеристики ионного транспорта. Основываясь на результатах наблюдения флуоресценции слитого белка MdCCX1-GFP в трансгенном табаке и клетках протопластов Arabidopsis , мы доказали, что MdCCX1 представляет собой белок, расположенный на плазматической мембране (рис. 2). Этот результат отличается от AtCCX1 и AtCCX2, но согласуется с OsCCX2 и AtSOS1.

Ионно-транспортные свойства MdCCX1 в дрожжах

Сравнение последовательностей и филогенетический анализ показали, что MdCCX1 был ортологом AtCCX1 в яблоке (рис. 1).Исследования по идентификации ионно-транспортной активности белков семейства CCX с использованием дрожжевого мутанта K667 показали, что, как члены семейства CaCA, белки CCX могут транспортировать Ca ^2+, и другие ионы. Таким образом, мы впервые идентифицировали ионную транспортную способность MdCCX1 с использованием дрожжевого мутанта K667. Неожиданно MdCCX1 не подавлял чувствительность K667 к высокому Ca ²⁺ и не подавлял чувствительность к другим ионам (Ba ²⁺ , Cu ²⁺ , Mg ²⁺ , Li ⁺ , Mn ²⁺ и Cd ²⁺ ) (Рисунок 3 и дополнительные рисунки 1A, B).

Экспрессия MdCCX1 сильно индуцировалась обработкой NaCl (рис. 1D), что позволяет предположить, что он может участвовать в солевой реакции растений яблони. Поэтому мы дополнительно идентифицировали транспортную способность MdCCX1 Na ⁺ с использованием двух чувствительных к Na ⁺ мутантов дрожжей, которые представляют собой одинарный мутантный штамм дрожжей Δ ena1-4 , в котором отсутствует ENA, и штамм дрожжей с двойными мутантами Δ ena1- 4 , Δ nha1 , в котором отсутствуют ENA и NHA на клеточной мембране.Их фенотип чувствительности к высокому уровню Na ⁺ сделал эти два штамма более подходящими, чем K667, для этого исследования. Обнадеживает то, что сверхэкспрессия MdCCX1 значительно подавляла чувствительность обоих мутантных штаммов дрожжей к высокому уровню Na ⁺ (Фиг.3B, C), что дополнительно подтверждается кривыми роста этих штаммов при обработке NaCl (Фигуры 3D, E). Поскольку ENA в дрожжах представляет собой АТФазу P-типа, ответственную за экскрецию Na ⁺ и избирательную абсорбцию K ⁺ , для дальнейшего изучения механизма MdCCX1 в повышении толерантности дрожжей к соли мы сверхэкспрессировали MdCCX1 в мутанте дрожжей R5421, чтобы исключить эффект K ⁺ (дополнительный рисунок 1C).Эти результаты, вместе с более низким содержанием Na ⁺ в MdCCX1 -трансформированных дрожжевых клетках при обработке NaCl (рис. 3F), предполагают, что MdCCX1 усиливает солевую толерантность, ингибируя накопление Na ⁺ в дрожжевых клетках, как и SOS1. белок в растениях.

MdCCX1 повышает толерантность растений к соли, ингибируя чрезмерное накопление Na

⁺

Как члены суперсемейства CaCA, белки CCX играют важную роль в регуляции роста растений и реакции на стресс, влияя на гомеостаз и накопление различных ионов.Однако исследований функции и передачи сигналов стресса белками CCX у растений немного, и было показано, что только AtCCX2 в Arabidopsis участвует в регуляции солеустойчивости, влияя на гомеостаз Ca ²⁺ (Corso et al. , 2018). Переносчики ионов опосредуют толерантность растений к соли, главным образом, транспортируя Na ⁺ из клетки (транспортеры, локализованные на плазматической мембране) или выделяя Na ⁺ в вакуоли (транспортеры, локализованные в тонопласте), тем самым снижая содержание Na ⁺ в клетках. цитозоль.Однако никакие исследования не показали, что белки CCX могут напрямую регулировать накопление Na ⁺ , регулируя солеустойчивость растений. В этом исследовании мы обнаружили, что MdCCX1 располагается на плазматической мембране растительных клеток (рис. 2) и ингибирует накопление Na ⁺ в дрожжах (рис. 3). Эти результаты предполагают, что MdCCX1 может иметь функцию ингибирования накопления Na ⁺ в растениях, что приводит к повышенной солеустойчивости, как и SOS1. В Arabidopsis AtSOS1 кодировал плазматическую мембрану-антипортер Na ⁺ / H ⁺ , который играет критическую роль в экструзии Na ⁺ из цитозоля в апопласт или обратно в почвенный раствор, а также в контроле над удалением Na ^{. +} транспорт от корня к побегу (Shi et al., 2002; Oh et al., 2010). Мы трансформировали MdCCX1 в Arabidopsis , каллусы яблони и корни растений яблони, чтобы подтвердить эту гипотезу, и идентифицировали влияние сверхэкспрессии MdCCX1 на толерантность растений к соли. Основываясь на фенотипическом сравнении и измерении физиологических показателей, связанных со стрессом, мы доказали, что избыточная экспрессия MdCCX1 значительно улучшает солевую толерантность трансгенных материалов (Рисунки 4-8). Кроме того, очевидное более низкое содержание Na ⁺ в этих трансгенных материалах свидетельствует о том, что гиперэкспрессия MdCCX1 значительно ингибирует избыточное накопление Na ⁺ при солевом стрессе (Фигуры 6, 7, 9).Эти результаты показывают, что, как мы исключили, MdCCX1 усиливает солеустойчивость растений за счет накопления Na ⁺ .

MdCCX1 повышает толерантность растений к соли, способствуя вымыванию активных форм кислорода

Производство АФК, вызванное солевым стрессом, используется в качестве физиологического индекса стрессового повреждения. Кроме того, чрезмерное накопление АФК в тканях растений приводит к окислительному повреждению, пагубному для роста и развития растений. В этом исследовании ROS в значительной степени индуцировалась обработкой солью у растений Arabidopsis и яблони (рисунки 5, 9 и дополнительный рисунок 3).Значительно более низкое накопление ROS в трансгенных растениях с избыточной экспрессией MdCCX1 (Фиг.5, 9 и Дополнительный Рисунок 3) предполагает, что эти растения меньше страдают стрессовым повреждением, вызванным высоким содержанием Na ⁺ . Этот результат во многом можно объяснить значительным снижением содержания Na ⁺ в этих трансгенных растениях (рис. 6, 8). Однако значительно более высокая активность антиоксидантных ферментов в этих трансгенных материалах с гиперэкспрессией MdCCX1 указывает на то, что может быть другая причина более низких АФК при солевом стрессе.По сравнению с контролем, активность антиоксидантных ферментов CAT, POD и SOD была значительно выше у трансгенного Arabidopsis с избыточной экспрессией MdCCX1 , каллусов яблони и растений яблони (Фигуры 6, 7, 9), что позволяет предположить, что MdCCX1 может способствовать активность этих антиоксидантных ферментов при солевом стрессе, что привело к снижению накопления АФК и уменьшению окислительного повреждения. Эти результаты предполагают, что, помимо ингибирования накопления Na ⁺ , MdCCX1 может также повышать устойчивость растений к соли, способствуя поглощению АФК.Это предположение согласуется с несколькими другими исследованиями растительных белков CCX (Li et al., 2016; Yan et al., 2020).

На основании результатов, полученных в этом исследовании, и предыдущих исследований других переносчиков ионов, связанных с солевым стрессом, мы предлагаем модель регуляции MdCCX1 солевой толерантности у растений яблони (рис. 10). В нормальных условиях уровень экспрессии MdCCX1 поддерживается на базовом уровне для поддержания ионного гомеостаза и нормального роста и развития растений.Когда растения подвергаются солевому стрессу, экспрессия MdCCX1 в корнях будет индуцироваться NaCl быстро и значительно. Тогда накопленный белок MdCCX1 мог ингибировать чрезмерное накопление Na ⁺ в корнях, опосредуя его отток из цитозоля в апопласт. Эта функция MdCCX1 может также способствовать переносу и диспергированию избыточного Na ⁺ из корней в другие ткани растения и его удалению из растения другими способами. С другой стороны, увеличение содержания Na ⁺ в растениях вызывает накопление MdCCX1 как в корнях, так и в листьях.Накопленный MdCCX1 способствует улавливанию ROS, стимулируя активность антиоксидантных ферментов, тем самым уменьшая окислительное повреждение, вызванное чрезмерным накоплением ROS при солевом стрессе. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы изучить, как MdCCX1 способствует активности антиоксидантных ферментов при солевом стрессе.

Рисунок 10. Рабочая модель, иллюстрирующая MdCCX1-опосредованный солевой ответ у растений яблони. В нормальных условиях уровень экспрессии MdCCX1 поддерживается на базовом уровне для поддержания ионного гомеостаза и нормального роста и развития растений.При солевом стрессе индуцируется экспрессия MdCCX1 , и белок MdCCX1 накапливается в корнях растений яблони. Накопленный белок MdCCX1 ингибирует накопление Na ⁺ в корнях, вытесняя избыток Na ⁺ во внеклеточное пространство или среду ризосферы. Эта функция MdCCX1 может также способствовать транспортировке и диспергированию Na ⁺ в другие ткани. Более того, при продолжающемся солевом стрессе увеличение содержания Na ⁺ вызывает накопление MdCCX1 как в корнях, так и в листьях, а накопленный MdCCX1, в свою очередь, способствует активности антиоксидантных ферментов по улавливанию ROS.Овалы представляют переносчики MdCCX1, а стрелки представляют направление транспорта Na ⁺ через клеточную мембрану.

Заявление о доступности данных

Все данные, подтверждающие выводы этого исследования, доступны в документе и в дополнительных данных, опубликованных в Интернете.

Авторские взносы

JY, KM и FM разработали проект и написали рукопись. JY и KM разработали план исследования. JY, WL, XG, PC и YC проводили эксперименты.JY, WL, XG и KM проанализировали данные. Все авторы прочитали и одобрили содержание.

Финансирование

Эта работа была поддержана Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2019YFD1000102), Национальным фондом естественных наук Китая (31972391/31701894), ключевыми специальными научно-техническими проектами провинции Шэньси (2020zdzx03–01-02) и Китайским Система сельскохозяйственных исследований Минфина и МАГА (CARS-27).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все претензии, выраженные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают претензии их дочерних организаций или издателей, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или заявление, которое может быть сделано его производителем, не подлежат гарантии или одобрению со стороны издателя.

Благодарности

Мы благодарим Yuanyuan Bu (Северо-восточный лесной университет) за предоставление мутанта дрожжей K667, чувствительных к Ca2 ⁺ , и благодарим Huazhong Shi (Техасский технический университет) и Jiafu Jiang (Нанкинский сельскохозяйственный университет) за предоставление дрожжей, чувствительных к Na ⁺ . мутанты.Яблочные калли («Орин») и саженцы «Гала» (GL-3) были любезно предоставлены Юйцзинь Хао (Шаньдунский сельскохозяйственный университет) и Чжинхун Чжан (Шэньянский сельскохозяйственный университет), соответственно.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.746189/full#supplementary-material

Дополнительный рисунок 1 | Толерантность трансформантов дрожжей, экспрессирующих MdCCX1 или pDR196, к различным ионам металлов. (A) Сравнение толерантности штаммов дрожжей K667, экспрессирующих MdCCX1 или pDR196, с Li ⁺ , Mn ²⁺ , Cd ²⁺ , Ba ²⁺ , Cu ²⁺ или Магний ²⁺ . (B) Фенотипы штаммов дрожжей R5421, экспрессирующих MdCCX1 или pDR196, выращенные в среде AP с добавлением различных концентраций K ⁺ . Фотографии были сделаны после 3 дней выращивания при 28 ° C. В эксперименте использовали по два положительных трансформатора каждого типа.

Дополнительный рисунок 2 | Идентификация трансгенного Arabidopsis и каллусов. (A) Идентификация ПЦР трансгена MdCCX1 на основе геномной ДНК, экстрагированной из растений Arabidopsis . Геномную ДНК, экстрагированную из растений «Col», и H ₂ O использовали в качестве отрицательного контроля, а векторную плазмиду MdCCX1 -pBI121 использовали в качестве положительного контроля. (B) Уровень экспрессии MdCCX1 в трансгенных растениях Arabidopsis . AtActin служил в качестве внутреннего эталонного гена. (C) Идентификация ПЦР трансгена MdCCX1 на основе геномной ДНК, выделенной из каллусов яблони. Геномную ДНК, экстрагированную из каллусов дикого типа и H ₂ O, использовали в качестве отрицательного контроля, а векторную плазмиду MdCCX1 -pBI121 использовали в качестве положительного контроля. (D) Уровень экспрессии MdCCX1 в трансгенных каллусах яблони. MdMDH служил в качестве внутреннего эталонного гена.Столбцы, помеченные разными буквами на каждой панели, значительно различаются ( p <0,05, односторонний анализ ANOVA и тест Дункана).

Дополнительный рисунок 3 | Гистохимическое окрашивание листьев яблони. (A) Гистохимическое окрашивание перекиси водорода (H ₂ O ₂ ) в листьях яблони с использованием NBT (нитросиний тетразолий). (B) Гистохимическое окрашивание супероксид-аниона (O ₂ ^— ) в листьях яблони с использованием DAB (3,3′-диаминобензидина).Масштабные линейки 3 см.

Сноски

Список литературы

Амагая, К., Сибуя, Т., Нишияма, М., Като, К., и Канаяма, Ю. (2019). Характеристика и анализ экспрессии семейства антипортерных генов Ca ²⁺ / катион в томатах. Заводы (Базель) 9:25. DOI: 10.3390 / растения25

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Асиф, М. А., Зафар, Ю., Икбал, Дж., Икбал, М. М., Рашид, У., Али, Г. М. и др. (2011). Повышенная экспрессия AtNHX1 в трансгенном арахисе (Arachis hypogaea L.) улучшает устойчивость к соли и засухе. Мол. Biotechnol. 49, 250–256. DOI: 10.1007 / s12033-011-9399-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баррос, Н. Л. Ф., Маркес, Д. Н., Тадаиески, Л. Б. А., и де Соуза, К. Р. Б. (2021). Галофиты и другие молекулярные стратегии для создания солеустойчивых культур. Plant Physiol. Biochem. 162, 581–591. DOI: 10.1016 / j.plaphy.2021.03.028

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цай, X., и Литтон, Дж. (2004). Суперсемейство катион / Ca ²⁺ : филогенетический анализ и структурные последствия. Мол. Биол. Evol. 21, 1692–1703. DOI: 10.1093 / molbev / msh277

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Че, Б., Ченг, К., Фанг, Дж., Лю, Ю., Цзян, Л., и Ю, Б. (2019).Ген ректогалофита tamarix TrSOS1 придает повышенную солеустойчивость трансгенным проросткам хлопчатника с волосистым корнем, демонстрирующим индуцированное вирусом сайленсинг гена GhSOS1. Внутр. J. Mol. Sci. 20: 2930. DOI: 10.3390 / ijms20122930

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен, З., Ву, Ю., Ди, Л., Шен, Ю., и Ван, Г. (2011). AtCCX1 транспортирует Na ⁺ и K ⁺ в Pitch pastoris. Afr. J. Biotechnol. 10, 9743–9750.DOI: 10.5897 / ajb11.455

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Клаф, С. Дж., И Бент, А. Ф. (1998). Цветочное погружение: упрощенный метод опосредованной Agrobacterium трансформации Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, 735–743. DOI: 10.1046 / j.1365-313x.1998.00343.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Корсо, М., Доккула, Ф. Г., де Мело, Дж. Р. Ф., Коста, А., и Вербрюгген, Н. (2018). CCX2, локализованный в эндоплазматическом ретикулуме, необходим для осмотолерантности за счет регуляции динамики ER и цитозольного Ca ²⁺ у Arabidopsis. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 115, 3966–3971. DOI: 10.1073 / pnas.1720422115

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Каннингем, К. В., и Финк, Г. Р. (1996). Кальциневрин ингибирует VCX1-зависимый обмен H ⁺ / Ca ²⁺ и индуцирует АТФазы Ca ²⁺ в Saccharomyces cerevisiae. Мол. Cell Biol. 16, 2226–2237. DOI: 10.1128 / mcb.16.5.2226

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дамм, Б., Шмидт, Р., и Виллмитцер, Л. (1989). Эффективная трансформация Arabidopsis thaliana с использованием прямого переноса генов в протопласты. Мол. Genet Genet. 217, 6–12. DOI: 10.1007 / BF00330935

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эмери Л., Уилан С., Хирши К. Д. и Питтман Дж. К. (2012). Белковый филогенетический анализ антипортеров Ca ²⁺ / катионов и понимание их эволюции в растениях. Фронтальный завод им. 3: 1.DOI: 10.3389 / fpls.2012.00001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гальвес, Ф. Дж., Багхур, М., Хао, Г., Каньяк, О., Родригес-Росалес, М. П., и Венема, К. (2012). Экспрессия изоформ LeNHX в ответ на солевой стресс у солеочувствительных и солеустойчивых видов томатов. Plant Physiol. Biochem. 51, 109–115. DOI: 10.1016 / j.plaphy.2011.10.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гитц, Р. Д., Шистл Р. Х., Виллемс А. Р. и Вудс Р. А. (1995). Исследования трансформации интактных дрожжевых клеток с помощью процедуры LiAc / SS-ДНК / PEG. Дрожжи 11, 355–360. DOI: 10.1002 / yea.320110408

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hang, N., Shi, T., Liu, Y., Ye, W., Taier, G., Sun, Y., et al. (2020). Сверхэкспрессия Os-microRNA408 повышает устойчивость к засухе райграса многолетнего. Physiol. Завод . 172, 733–747. DOI: 10.1111 / чел.13276

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хао, Х., Цзэн, М., Ван, Дж., Цзэн, З., Дай, Дж., Се, З. и др. (2018). Узловой транспортер OsCCX2 участвует в накоплении кадмия в зернах риса. Перед. Plant Sci. 9: 476. DOI: 10.3389 / fpls.2018.00476

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эрнандес-Пьедра, Г., Руис-Каррера, В., Санчес, А. Дж., Аспейтиа-Моралес, А., и Кальва-Кальва, Г. (2020).Индукция волосистых корней на соматических зародышах ризоклонов проростков typha domingensis. Plants (Базель) 9: 1679. DOI: 10.3390 / растения79

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кумар, С., Калита, А., Шривастава, Р., и Саху, Л. (2017). Совместная экспрессия NHX1 арабидопсиса и батончика улучшает устойчивость к засолению, окислительному стрессу и гербицидам у трансгенного маша. Перед. Plant Sci. 8: 1896. DOI: 10.3389 / fpls.2017.01896

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, Й.Й., Мао, К., Чжао, К., Чжао, X.Y., Чжан, Х.Л., Шу, Х.Р. и др. (2012). Убиквитин E3-лигазы MdCOP1 взаимодействуют с MdMYB1 для регулирования индуцированного светом биосинтеза антоцианов и окраски красных плодов яблони. Plant Physiol. 160, 1011–1022. DOI: 10.1104 / стр.112.199703

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ли, З., Ван, X., Чен, Дж., Гао, Дж., Чжоу, X., и Куай, Б. (2016). CCX1, предполагаемый обменник катионов / Ca ²⁺ , участвует в регуляции гомеостаза активных форм кислорода и старения листьев. Physiol растительных клеток. 57, 2611–2619. DOI: 10.1093 / pcp / pcw175

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Liang, B., Li, C., Ma, C., Wei, Z., Wang, Q., Huang, D., et al. (2017). Дофамин снимает стресс, вызванный дефицитом питательных веществ, у Malus hupehensis. Plant Physiol. Biochem. 119, 346–359.DOI: 10.1016 / j.plaphy.2017.09.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ливак К. Дж. И Шмитген Т. Д. (2001). Анализ данных относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2 ^{— △△ CT} . Методы 25, 402–408. DOI: 10.1006 / meth.2001.1262

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мао, К., Дун, К., Ли, К., Лю, К., и Ма, Ф. (2017). Полногеномная идентификация и характеристика факторов транскрипции bHLH яблока и анализ экспрессии в ответ на засуху и солевой стресс. Перед. Plant Sci. 8: 480. DOI: 10.3389 / fpls.2017.00480

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мао, К., Ян, Дж., Ван, М., Лю, Х., Го, X., Чжао, С. и др. (2021 г.). Полногеномный анализ суперсемейства яблочного CaCA показывает, что белки MdCAX участвуют в реакции на абиотический стресс как переносчики кальция. BMC Plant Biol. 21:81. DOI: 10.1186 / s12870-021-02866-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Моррис, Дж., Тиан, Х., Парк, С., Сревидья, К.С., Уорд, Дж. М., и Хирши, К. Д. (2008). AtCCX3 представляет собой эндомембранный переносчик H ⁺ Arabidopsis, зависимый от K ⁺ . Plant Physiol. 148, 1474–1486. DOI: 10.1104 / стр.108.118810

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ни, В. X., Сюй, Л., и Ю, Б. Дж. (2015). Предполагаемый GmsSOS1 сои придает повышенную солеустойчивость трансгенному мутанту sos1-1 Arabidopsis. Protoplasma 252, 127–134.DOI: 10.1007 / s00709-014-0663-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

О, Д. Х., Ли, С. Ю., Брессан, Р. А., Юн, Д. Дж., И Бонерт, Х. Дж. (2010). Внутриклеточные последствия дефицита SOS1 при солевом стрессе. J. Exp. Бот. 61, 1205–1213. DOI: 10.1093 / jxb / erp391

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Олиас, Р., Эльджакауи, З., Ли, Дж., Де Моралес, П. А., Марин-Манзано, М. К., Пардо, Дж. М. и др. (2009). Плазматическая мембрана Na ⁺ / H ⁺ -антипортер SOS1 важна для солеустойчивости томатов и влияет на распределение Na + между органами растения. Plant Cell Environ. 32, 904–916. DOI: 10.1111 / j.1365-3040.2009.01971.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Питтман, Дж. К., и Хирши, К. Д. (2016). Филогенетический анализ и моделирование структуры белка позволяют идентифицировать отдельные антипортеры Ca ²⁺ / катионов и сохранение структуры семейства генов у арабидопсиса и видов риса. Рис (Нью-Йорк) 9: 3. DOI: 10.1186 / s12284-016-0075-8

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ши, Х., Ishitani, M., Kim, C., and Zhu, J.K. (2000). Ген солеустойчивости Arabidopsis thaliana SOS1 кодирует предполагаемый антипортер Na ⁺ / H ⁺ . Proc. Natl. Акад. Sci. USA 97, 6896–6901. DOI: 10.1073 / pnas.120170197

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ши, Х., Кинтеро, Ф. Дж., Пардо, Дж. М. и Чжу, Дж. К. (2002). Предполагаемая плазматическая мембрана Na ⁺ / H ⁺ -антипортер SOS1 контролирует дальний транспорт Na ⁺ в растениях. Растительная клетка 14, 465–477. DOI: 10.1105 / tpc.010371

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сингх А., Канвар П., Ядав А. К., Мишра М., Джха С. К., Баранвал В. и др. (2014). Полногеномный экспрессионный и функциональный анализ элементов транспорта кальция во время абиотического стресса и развития у риса. FEBS J. 281, 894–915. DOI: 10.1111 / febs.12656

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Песня, А., Лу, Дж., Цзян, Дж., Чен, С., Гуань, З., Фанг, В., и др. (2012). Выделение и характеристика Chrysanthemum crassum SOS1, кодирующего предполагаемый антипортер плазматической мембраны Na ⁺ / H ⁺ . Завод. Биол. (Штутг) 14, 706–713. DOI: 10.1111 / j.1438-8677.2011.00560.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Соттосанто, Дж. Б., Саранга, Ю., и Блюмвальд, Э. (2007). Влияние AtNHX1, вакуолярного антипортера Na ⁺ / H ⁺ , на экспрессию генов во время краткосрочного и длительного солевого стресса у Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 7:18. DOI: 10.1186 / 1471-2229-7-18

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Танеджа М., Тьяги С., Шарма С. и Упадхьяй С. К. (2016). Ca ²⁺ / Катионные антипортеры (CaCA): идентификация, характеристика и профили экспрессии в мягкой пшенице (Triticum aestivum L.). Перед. Plant Sci. 7: 1775. DOI: 10.3389 / fpls.2016.01775

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, П., Ли, З., Вэй, Дж., Чжао, З., Сун, Д., и Цуй, С. (2012). Обменник-подобный белок Na ⁺ / Ca ²⁺ (AtNCL) участвует в солевом стрессе у Arabidopsis. J. Biol. Chem. 287, 44062–44070. DOI: 10.1074 / jbc.M112.351643

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сян, Т. Х., Ван, Л. Л., Панг, Дж. Л., Чен, М., и Сюй, К. (2005). [Волосатый корень, индуцированный агробактерией дикого типа rhizogenes K599 в сое, огурце и садовом бальзаме in vivo]. И Чуань 27, 783–786.

Google Scholar

Ядав, А.К., Шанкар, А., Джа, С.К., Канвар, П., Панди, А., и Панди, Г.К. (2015). Тонопластический кальций-обменник риса, OsCCX2, опосредует транспорт катионов Ca ²⁺ / в дрожжах. Sci. Отчет 5: 17117. DOI: 10.1038 / srep17117

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ян, К., Ран, М., Ли, С., Чжан, Дж., Ван, Ю., Ван, З. и др. (2020). Задержка старения почек после сбора урожая в ионах соли была связана с антиоксидантной активностью HDA9 и CCX1 в брокколи (Brassica oleracea L.var. Курсив Planch.). Food Chem. 324: 126887. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2020.126887

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Йокои С., Кинтеро Ф. Дж., Куберо Б., Руис М. Т., Брессан Р. А., Хасегава П. М. и др. (2002). Дифференциальная экспрессия и функция антипортеров Arabidopsis thaliana NHX Na ⁺ / H ⁺ в ответе на солевой стресс. Plant J. 30, 529–539. DOI: 10.1046 / j.1365-313x.2002.01309.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжан, X., Чжан, М., Такано, Т., и Лю, С. (2011). Характеристика гена AtCCX5 из Arabidopsis thaliana, который связан с высокоаффинным захватом K ⁺ и транспортом Na ⁺ в дрожжах. Biochem. Биофиз. Res. Commun. 414, 96–100. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2011.09.030

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhou, K., Hu, L., Li, Y., Chen, X., Zhang, Z., Liu, B., et al. (2019). MdUGT88F1-опосредованный биосинтез флоридзина регулирует развитие яблони и устойчивость к раку валсы. Plant Physiol. 180, 2290–2305. DOI: 10.1104 / стр.19.00494

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Набор для сбора листьев Marion с 25 октября по 10 декабря

Сбор листьев начнется 25 октября

Сбор листьев для жителей Marion начнется 25 октября и продолжится до 10 декабря.

Есть три варианта утилизации. листьев. Вы можете поместить листья на лужайке с деревьями, чтобы их очистить пылесосом. Листья также могут быть помещены в биоразлагаемые бумажные пакеты для городского пикапа, который будет соответствовать ограничениям на вывоз мусора во дворе, составляющим три мешка и три пачки на дом каждую неделю.Сумки можно приобрести в местных магазинах.

Третий вариант: отнести листья в биоразлагаемых бумажных пакетах в Outdoor Resource Supply, 560 Barks Road W. Это место будет открыто для жителей города бесплатно. Вам нужно будет остановиться в офисе или другом указанном месте, где может потребоваться подтверждение проживания в городе. Отбрасываемые предметы должны быть взвешены сотрудником отдела наружного снабжения до того, как материалы будут выброшены. Если для сбора используются мешки, не поддающиеся биологическому разложению, листья необходимо опорожнять во время высадки.

Должностные лица напоминают жителям не сгребать листья на городских улицах и / или парковках. Это может быть привлекательным для детей или представлять угрозу безопасности пешеходов и / или людей, путешествующих на автомобиле. Он также может блокировать поток воды в городские водосборные бассейны, препятствуя надлежащему дренажу в нашу ливневую канализационную систему во время дождей в осенний сезон.

За дополнительной информацией обращайтесь в отдел санитарии / улиц по телефону 740-382-1479.

Мероприятие по бесплатному сбору шин в эту субботу

Команда Love Our Neighborhoods проведет мероприятие по бесплатному сбору шин с 9 а.м. — 13:00 Суббота в парке Сойера Людвига, 1313 White Oaks Road.

Эта коллекция предназначена только для жителей Марион. Физические лица должны предъявить доказательства проживания в городе, например водительские права или счет за коммунальные услуги. На одно домохозяйство будет установлено не более 10 шин. Большие шины (тракторные или полуавтоматические) не принимаются. Это мероприятие распространяется только на шины из жилых районов. Шины от коммерческих дилеров или предприятий не принимаются.

Для получения дополнительной информации позвоните по телефону 740-387-2248 или напишите по электронной почте sthrapp @ marionohio.орг.

Финансирование этого проекта осуществляется через Службу общественного здравоохранения города Марион и Мэрион.

Офис шерифа усиливает контроль во время сезона возвращения на родину

Шериф округа Мэрион Мэтт Бейлс говорит, что его офис участвует в общегосударственном дорожном движении, нацеленном на нарушения, связанные со скоростью и алкоголем, во время танцев для возвращения на родину в старших классах. Депутаты проводят дополнительное усиление контроля за дорожным движением и патрулирование до воскресенья.

Стремясь обеспечить безопасность автомобилистов, офис шерифа будет применять политику нулевой терпимости в отношении превышения скорости, вождения в нетрезвом виде и нарушений ремней безопасности.Жителей округа Мэрион призывают соблюдать правила дорожного движения, чтобы обеспечить безопасный и приятный сезон возвращения домой.

Эти дополнительные патрульные мероприятия стали возможными благодаря гранту Департамента общественной безопасности Огайо и Управления безопасности дорожного движения при губернаторе.

Земельный комиссар Северной Дакоты переходит на 5 месяцев во второй срок | Новости Северной Дакоты

БИСМАРК, Н.

Комиссар Департамента доверительных земель Джоди Смит уходит в отставку 28 октября. Она была назначена Государственным советом университетов и школьных земель, известным как Земельный совет, в 2017 году и повторно назначена на второй срок в июне.

Земельный департамент сдает в аренду права на выпас скота и право добычи нефти, угля и гравия на государственных землях. Он управляет несколькими государственными целевыми фондами, в том числе целевым фондом общих школ, который приносит пользу государственным школам.

Непонятно, почему Смит решил поскорее выйти.В своем заявлении она заявила, что будет помнить свое время в качестве уполномоченного с «большой любовью» и предложила выступить в качестве консультанта после того, как уйдет в отставку.

«Я исключительно горжусь нашими достижениями, горжусь своей командой за их неутомимую преданность делу и с нетерпением жду следующих шагов в моей карьере после этих значительных достижений», — сказала она.

Политические карикатуры

Земельный совет подвергся критике со стороны нефтегазовой отрасли за попытку получить невыплаченные гонорары.Это привело к принятию закона, принятого ранее в этом году, который ограничивает размер процентов, которые компании должны платить за невыплаченные роялти за нефть и газ, и устанавливает срок давности в отношении того, сколько времени они должны платить.

На собрании Земельного совета, когда Смит был утвержден на второй срок, некоторые члены жаловались на то, как проблема публично освещается, и приказывали Смиту разработать политику в отношении СМИ, в которой изложены принципы взаимодействия с репортерами.

Земельный совет, состоящий из пяти человек, состоит из Gov.Дуг Бургам в качестве председателя и суперинтендант школ Кирстен Баеслер, казначей Томас Бидл, государственный секретарь Аль Джагер и генеральный прокурор Уэйн Стенехджем в качестве членов.

No related posts.