Векторный глаз: Изображения Глаз | Бесплатные векторы, стоковые фото и PSD
%d0%b3%d0%bb%d0%b0%d0%b7%d0%b0 %d0%b2%d0%b5%d0%ba%d1%82%d0%be%d1%80 PNG, векторы, PSD и пнг для бесплатной загрузки
Мемфис дизайн геометрические фигуры узоры мода 80 90 х годов
4167*4167
поп арт 80 х патч стикер
3508*2480
поп арт 80 х патч стикер
3508*2480
green environmental protection pattern garbage can be recycled green clean
2000*2000
естественный цвет bb крем цвета
1200*1200
ма дурга лицо индуистский праздник карта
5000*5000
Мемфис шаблон 80 х 90 х годов стилей фона векторные иллюстрации
4167*4167
набор векторных иконок реалистичные погоды изолированных на прозрачной ба
800*800
80 летний юбилей дизайн шаблона векторные иллюстрации
4083*4083
be careful to slip fall warning sign carefully
2500*2775
поп арт 80 х патч стикер
3508*2480
вектор поп арт иллюстрацией черная женщина шопинг
800*800
Мемфис бесшовные модели 80 х 90 х стилей
4167*4167
мемфис бесшовной схеме 80s 90 все стили
4167*4167
поп арт 80 х патч стикер
2292*2293
аудиокассета изолированные вектор старая музыка ретро плеер ретро музыка аудиокассета 80 х пустой микс
5000*5000
ценю хорошо как плоская цвет значок векторная icon замечания
5556*5556
80 е брызги краски дизайн текста
1200*1200
поп арт 80 х патч стикер
3508*2480
вектор поп арт иллюстрацией черная женщина шопинг
800*800
поп арт 80 х патч стикер
3508*2480
поп арт 80 х патч стикер
2292*2293
дизайн плаката премьера фильма кино с белым вектором экрана ба
1200*1200
happy singing mai ba sing self indulgence happy singing
2000*2000
поп арт 80 х патч стикер
3508*2480
Диско вечеринка в стиле ретро 80 х art word design
1200*1200
80 летний юбилей дизайн шаблона векторные иллюстрации
4083*4083
Неоновый эффект 80 х годов Ретро вечеринка арт дизайн
1200*1200
новые facebook покрытия с red lion и черный и синий полигональной ба
5556*5556
крем крем вв вв на воздушной подушке иллюстрация
2000*2000
ретро стиль 80 х годов диско дизайн неон плакат
5556*5556
диско дизайн в стиле ретро 80 х неон
5556*5556
поп арт 80 х патч стикер
3508*2480
скейтборд в неоновых цветах 80 х
1200*1200
в эти выходные только мега продажи баннер скидки до 80 с
10418*10418
break split orange be
2000*2000
bb крем ню макияж косметика косметика
1200*1500
Мода цвет 80 х годов ретро вечеринка слово искусства
1200*1200
Ретро мода 80 х градиент цвета художественного слова
1200*1200
поп арт 80 х патч стикер
3508*2480
витамин b3 логотип значок дизайн типы
1200*1200
скачать букву т серебро 80 х
1200*1200
скидки до 80 предписанию» векторный дизайн шаблона иллюстрация
4083*4083
Ретро ТВ игра 80 х годов в стиле арт дизайн
1200*1200
Модный стиль ретро 80 х годов дискотека тема искусства слово
1200*1200
Тенденция персонажа мультфильма 80 х годов
2000*2000
80 х годов ретро слово градиент цвета искусства
1200*1200
мега распродажа 80
1200*1200
80 е в стиле ретро мода цвет градиент арт дизайн
1200*1200
Рождество 80 х годов ретро пиксель
9449*5315
Векторный глаз eps ai | UIDownload
Векторный глаз eps aiключевые слова
- Абстрактные
- Изобразительное искусство
- фон
- мяч
- красивая
- синий
- бизнес
- мультфильм
- мультфильмы
- круг
- крупный план
- коллекция
- цвет
- концепция
- творческий
- украшение
- декоративный
- дизайн
- цифровой
- Рисование
- элемент
- глаз
- глазное яблоко
- генерируется
- глянцевый
- человек
- иллюстрация
- изображение
- Ирис
- изолированные
- изоляция
- Смотреть
- объекты
- оптический
- люди
- видеть
- форма
- стиль
- символ
- Посмотреть
- зрение
- смотреть
- белый
- Векторный глаз
- eps
- ai
- Векторный
DMCA Contact Us
бесплатная загрузка ( eps ai, 6.24MB )Связанная векторная графика
- Векторные глаза ai eps
- Смешные комиксы глаза векторный материал ai
- Глаза Векторные изображения ai
- Набор векторных мультфильм глаза eps
- Глаза и рты ai
- Набор векторных разные глаза eps
- Вектор красивые глаза eps
- Woman39s глаза вектор cdr
- Глаза Графика ai
- Черный кот глаза Векторный фон (бесплатно) eps
- Глаза как мы eps ai
- Красочные глаза вектор ai
- Глаз реалистичный eps ai
- абстрактный глаз векторная графика ai eps
- Набор выражений глаз и ртов
- Набор векторных мультфильм глаза eps
- Вектор красивые глаза eps
- Детские драконы с милыми глазами eps
- Классические элементы дизайна племени стрелки глаза солнце значки eps ai
- человеческий глаз картинки eps ai
- голубой глаз ai eps
- Мультфильм глаза силуэт вектор eps
- Глаз Графика Логотип eps
- Глаз Гора ai
- изображение женских глаз cdr eps ai
- глаз женщины eps ai
- Глаза Векторы ai
- Женские глаза 2 ai
- Вектор аниме глаза ai
- злые глаза векторное изображение eps
- Блестящий синий вектор глаз eps ai
- 16 моделей милые мультяшные животные большие глаза вектор eps
- Разные глаза дизайн вектор eps
- Вектор глаза вектор глаза ai eps
- Красивый глаз ai
- Бесплатные векторные иконки глаз доктор глаз eps svg
- Красивые глаза векторная графика eps
- Красивые глаза векторная графика eps
- злые глаза векторные картинки eps
- Разнообразные мультяшные глаза и ai
- Бесплатные векторные глаза ai eps
- Вектор поп-арт женщина мечтает с закрытыми глазами eps
- Различные глаза дизайн вектор eps
- Глаза Векторы ai
- Contact Us
Векторный лифтинг глаз — Косметологическая клиника в Барнауле «Центр доктора Кривошеевой»: услуги врачебной косметологии и эстетической медицины
Описание
Векторный лифтинг – восстановление овала лица и плотности кожи.
Молодое лицо симметрично и имеет форму буквы «V». Чем моложе лицо, тем более упругая кожа и четкие контуры.
После 25-30 лет кожа начинает стареть. Вокруг глаз и рта появляются первые морщины. Они постепенно углубляются и превращаются в четко различимые складки и морщины. С годами изменяются и пропорции лица, объем мягких тканей уменьшается. Щеки опускаются вниз, подбородок теряет упругость, линия скул начинает провисать, и лицо расширяется книзу. Лицо теряет четкость контура и становится не таким упругим и гладким, как раньше. Буква «V» «переворачивается».
В чем секрет буквы «V»?
«V-эффект» – это ключ к восстановлению молодости лица. Коррекции каждой морщины по отдельности не достаточно, лицу нужно полноценное комплексное омоложение. При правильной технике инъекции и правильном выборе объема лицо восстановит оптимальную V-образную форму, характерную для молодого лица, а морщины и провисание щек уйдут сами собой.
«V-эффект» может быть достигнут с помощью дермального филлера Radiesse. Во время процедуры препарат с помощью специальной канюли (очень тонкой и гибкой иглы с тупым кончиком) вводится по индивидуальной схеме в зависимости от типа старения. Обычно проводится не более 2-х проколов кожи, а канюля, благодаря своей гибкости, не повреждает сосуды. Поэтому после процедуры обычно не остается следов на коже.
После инъекции гелевая основа препарата, в котором находятся микросферы действующего вещества, восполняет дефекты объема и обеспечивает немедленный лифтинг-эффект и коррекцию морщин.
Кальциевые микросферы стимулируют выработку кожей собственного коллагена, который еще больше увеличивает объем и возвращает лицу V-форму. Он помогает восстановить здоровый, молодой вид, усилить выразительность некоторых черт лица, замедлить признаки старения и, самое главное, помочь вновь обрести уверенность в себе – и все это без хирургических вмешательств. Результаты коррекции сохраняются более 12 месяцев.
|
1. С помощью инструмента «Свободная рука» создайте контур глаза и верхнее веко, форму объектов скорректируйте с помощью «Формы»: 2. Нарисуйте еще один контур и примените на него заливку с линейной направленно-стью. В настройках выставьте цвета: CMYK (0;60;60;40) и (71;89;88;39). 3. С помощью инструмента «Эллипс» нарисуйте овал, залейте его розовым цветом (2;16;9;0) примените на него инструмент «Интерактивная полупрозрачность», линейного типа. Далее нарисуйте такой же небольшой эллипс у основания глаза, немного повернув его и залив цветом (10;44;45;0). Снимите обводку. 4. Инструментом «Свободная рука» нарисуйте еще один объект, залейте его цветом (3;26;37;0) и примените «Интерактивную прозрачность» базового типа. Нарисуйте еще один штрих, залейте его цветом (44;79;86;3), к нему также примените «Интерактивную прозрачность», но уже линейного типа. 5. Возле этого штриха сделайте еще один (можно также скопировать первый), который залейте цветом (3;20;25;0), с применением полупрозрачности. 6. Нарисуйте поверх изображений еще один эллипс, т.е. овал. Залейте его градиентом с цветами: (0;20;20;0) и (0;20;40;40) и примените базовую полупрозрачность. 7. Теперь над складочкой века необходимо нарисовать следующую фигуру и все тем же эллипсом нарисовать белок глаза. Обе фигуры залейте белым цветом и примените ли-нейную полупрозрачность. 8. Инструментом «Эллипс» нарисуйте окружность, залейте ее серым цветом и примени-те к ней инструмент «Тень». 9. На полученную окружность с тенью примените полупрозрачность. 10. Над глазом, а именно на веке нарисуйте «Свободной рукой» некое подобие теней для глаз, объект залейте розовым цветом (2;16;9;0), делая акцент на естественность. Под гла-зом также нарисуйте фигуру. К обеим полученным фигурам примените линейную полу-прозрачность. 11. Инструментом «Эллипс» нарисуйте вторую окружность поверх первой. Залейте ее цветом (67;54;81;12) и примените инструмент полупрозрачности с линейным типом, также к этой окружности добавьте контур темного цвета. Слева нарисуйте объект, кото-рый будет затемнен, он имеет заливку цветом (4;30;38;0). 12. Нарисуйте радужную оболочку глаза, примените инструменты «Контуры» и «Инте-рактивное искажение» (искажение вогнутости и выпуклости). Выходящие за контуры линии подкорректируйте ластиком. Цвет заливки — (78;66;81;46). 13. Нарисуйте на зрачке еще одну окружность, залейте ее цветом (65;52;74;8) и приме-ните базовую полупрозрачность. 14. Следующая окружность не содержит заливку, а только серый цвет контура. 15. С помощью «Свободной руки» изобразите небольшую окружность, залейте ее белым цветом и примените базовую полупрозрачность. 16. Поверх зрачка нарисуйте две окружности, одна большая цветом, другая — сам зрачок (обе черного цвета). Большую окружность сделайте полупрозрачной (базовый тип). 17. Далее на маленьком зрачке примените градиентный переход (от черного к темно-зеленому). 18. Нарисуйте блики и примените базовую полупрозрачность. 19. Изобразите еще один блик, похожий на перевернутое сердце, примените к нему ли-нейную полупрозрачность. 20. С помощью инструмента «Свободная рука» изобразите реснички, это будут не ос-новные реснички, а только основание. Набросайте «от руки», а затем подкорректируйте все с помощью «Формы», придайте плавность и заостренность. 21. На полученные «реснички» накладывается тень. 22. С помощью инструмента «Живопись» нарисуйте «настоящие» реснички на верхнем и нижнем веках. Вариант вечернего макияжа.
Добавьте блеск в глазах. Меняйте цвет теней, корректируя макияж. Вернуться к выбору уроков. |
Коррекция морщин вокруг глаз | Цена
Возраст женщины определяется по глазам. Гладкая и нежная кожа вокруг глаз — признак молодости. Но с каждым прожитым годом все труднее сохранить ее такой.
Кожа в этой зоне гораздо тоньше, чем на других участках лица. В области глаз отсутствуют сальные железы и жировой слой, поэтому она склонна к сухости. А вместе с тем на эту область приходится большая мимическая нагрузка.
В результате первые мимические морщинки («гусиные лапки») появляются еще в молодости, и постепенно их становится всё больше.
Однако этому процессу можно успешно противостоять. Простым, быстрым и эффективным решением задачи сохранения молодости кожи вокруг глаз является ботулинотерапия.
В область «гусиных лапок» делаются инъекции ботулотоксина типа А, который блокирует мимические мышцы. В результате кожа «отдыхает» от мимической нагрузки и морщины не образуются. Препарат действует в течение полугода. Весь этот период гладкая кожа выглядит свежей и бархатной. Через полгода процедуру рекомендуется повторить.
Процедура часто сочетается с ботулинотерапией области лба и межбровья.
Также прекрасным дополнением процедуры может быть введение филлеров на основе гиалуроновой кислоты для камуфлирования носослезной и пальпебромалярной (между нижним веком и щекой) борозд.
- Естественно. В результате проведения процедуры мимические морщины вокруг глаз исчезают, а живая мимика лица при этом сохраняется.
- Безопасно. Процедуры проводят профессионалы нашей клиники с применением Ксеомина — высокоочищенного безбелкового препарата ботулотоксина А, не вызывающего аллергии и привыкания.
- Комфортно и безболезненно. Инъекции выполняются тонкой иглой, абсолютно безболезненны и не требуют анестезии.
- Консультация. Перед проведением процедуры проводится осмотр и консультация, на которой врач выслушивает пожелания пациента и определяет зоны необходимой коррекции мимических морщин.
- Очищение зоны коррекции и разметка. В зоне вокруг глаз очищается декоративная косметика, специальным карандашом наносится разметка мест будущих инъекций.
- Инъекция ботулотоксина А. С помощью тонкой иглы в намеченные карандашом места вводится препарат. Процедура проводится в течение 30 минут. Она абсолютно безболезненна, не требует последующей реабилитации. Сразу же после ее проведения пациент может вернуться к повседневным делам.
- Накануне предстоящей процедуры необходимо воздержаться от употребления алкоголя и лекарственных препаратов, снижающих свертываемость крови.
- Мимические морщины начинают разглаживаться на 3-4 день после введения ботулотоксина А. Полный эффект достигается через 14 дней и длится 4-6 месяцев.
- Ботулинотерапия хорошо сочетается с другими косметологическими процедурами (контурная пластика филлерами, мезотерапия, биоревитализация и др.)
- беременность, период лактации и кормления
- наличие острых инфекционных заболеваний
- онкологические заболевания
- воспалительные процессы в области воздействия
- нарушение свертываемости крови, прием антикоагулянтов
- различные декомпенсированные состояния органов и систем
Ксеомин (Xeomin) (Германия)
Ботулакс (Корея)
Диспорт
Стоимость процедуры формируется в зависимости от задач пациента и его физиологических особенностей.
Для поддержания идеального состояния кожи в области вокруг глаз рекомендуем использовать:
Правильно подобранный крем или гель для глаз из профессиональной косметики, например Скин Сьютикал, а также специальные пачи и маски для глаз.
Мезопрепараты и биоревитализанты для дополнительного увлажнения этой зоны, например Гиалуаль, МезоАй.
Клиника эстетической медицины в Москве. Интегративный подход. Современное оборудование.
Вячеслав Супранович
Много лет имел проблему с кожей спины, запущенное акне. Елизавета Михайловна посоветовала уход и лечение. Уже за полтора месяца состояние улучшилось в разы, сейчас только единичные воспаления, где раньше здоровой кожи сантиметра не было. Огромное спасибо!
Дарья Шелякина
Потрясающая клиника! Я очень долго пыталась найти своего косметолога с момента переезда, в этой клинике все врачи классные!! Я была на процедуре у Елизаветы Кравченко и у Екатерины Ворошкевич — девочки просто удивительные, добрые, помогли разобраться в моих проблемах и подобрали лучший сценарий моего лечения! Спасибо большое! Всем советую!
Ольга Игнатова
Для начала о встрече! Для моего автомобиля было заранее приготовлено место парковки! И это супер! На ресепшн угостили кофе. Доктор очень понравился. Сделала сразу несколько процедур. Получила план лечения. Я очень довольна. Давно искала косметолога, которому можно доверять! Рекомендую эту клинику! И желаю ей процветания!!!!!
Nikoletta A.
Чудесная клиника, современная и стильная. Спасибо Ольге Эдуардовне Рябовой за подобную консультацию и качественно проведённую процедуру! Чувствуешь что перед тобой профессионал и человек который любит свою работу. С радостью приду к вам вновь.
Дарья
Потрясающая клиника! Я очень долго пыталась найти своего косметолога с момента переезда, в этой клинике все врачи классные!! Я была на процедуре у Елизаветы Кравченко и у Екатерины Ворошкевич — девочки просто удивительные, добрые, помогли разобраться в моих проблемах и подобрали лучший сценарий моего лечения! Спасибо большое! Всем советую!
Галина
Супер клиника и замечательная основательница Павленко Оксана Юрьевна, умница с «золотыми руками». Рекомендую
Екатерина
«Оксана, я Ваша на веки». Сложно что- то написать так, чтобы это не выглядело как лозунг. В Innovation я прихожу не к косметологу, а к доктору и я точно знаю, что после процедуры у меня не замкнёт мышцу, не случится негативная реакция на препарат и на следующий день, я смогу пойти на работу и мне не нужно 2 недели прятаться от людей, пока не пройдут синяки и отеки. В клинике много аппаратных процедур и в целом у докторов клиники много решений, которые могут помочь не прибегая к инъекционным методам и это очень круто, когда косметолог даёт тебе информацию и цель — достижение результата направленного на здоровье и эстетику, а не на кол-во проданных инъекций, которые могут быстро решить одну проблему и создать много других. Клиника следит за своей репутацией и подход к проведению любых процедур профессиональный, вы точно попадёте в руки врачей, а «вишенка на торте» это прекрасная атмосфера клиники.
Юля
Хочу сказать огромное спасибо, замечательному доктору Оксане Павленко, за ее волшебные руки! Пять лет назад попала к Оксане моделью с косметологом из Одинцово. Процедура носослезная борозда. У меня всегда были как синяки под глазами, со здоровьем все хорошо, а вид был уставший. Супруг сразу заметил колоссальное изменение, глазки сияют, здоровый вид. Прошло пять лет, сказать что я в восторге не чего не сказать. Синевы под глазами нет до сих пор. Спасибо Вам большое!
Наталия
Добрый вечер! Сегодня ,8 мая первый раз посетила вашу клинику . Клинику мне посоветовала подруга , которая обращается только к вам . При входе на ресепшн встречает обаятельная и красивая девушка администратор Элина. Записана я была к доктору Ворошкевич Екатерине. Екатерина очень внимательная , грамотная , профессионал своей работы . Буду всем знакомым и друзьям советовать вашу клинику . Спасибо что вы есть , с уважением Наталия.
Векторный лифтинг лица — особенности процедуры и отзывы, фото до и после 2021
Содержание статьи
Исправить возрастные изменения кожи лица и тела раньше могла только пластическая хирургия, но современная медицина предлагает альтернативные безоперационные методики, которые отличаются высокой эффективностью и полной безопасностью. Векторный лифтинг разработан специально для замены хирургического вмешательства и приравнивается к пластической подтяжке.
Преимущества векторного лифтинга перед операционными методиками:
- полная безопасность для здоровья;
- отсутствие надобности использовать общий наркоз;
- отсутствие рубцов после процедуры;
- короткий реабилитационный период;
- минимальный риск появления осложнений;
- пролонгированный эффект.
Как проводится векторный лифтинг и кому показан
Суть метода коррекции лица при помощи векторного лифтинга заключается во внедрении под кожу специальных филеров на основе гиалуроновой кислоты, которые создают прочный каркас. Препараты вводятся канально – это позволяет сформировать четкие линии каркаса. Если у пациента обнаружен недостаток подкожных тканей, то могут использоваться и болюсные (объемные) инъекции, что способствует устранению всех недостатков.
Вводятся филеры при помощи очень тонких игл или канюль и образуют так называемую сетку, после чего вокруг нее ткани сокращаются, вырабатывая собственный коллаген. Это и обеспечивает подтяжку, которая видна сразу же после процедуры.
Так как коллагеновые нити рассасываются в течение 21 дня, полностью оценить результат можно спустя 3-4 недели. Все это время препарат будет обеспечивать активное образование коллагеновых волокон, эластина и белков, что придаст коже упругость, увлажнение и заметное омоложение.
Показаниями к процедуре являются такие факторы:
- наличие опущения уголков глаз и губ;
- формирование морщин разной глубины и локации;
- обвислость кожи и ее дряблость;
- начало возрастных изменений.
Несмотря на то, что к процедуре векторного лифтинга чаще всего прибегают женщины после 35 лет, она очень эффективна как профилактика возрастных изменений.
Молодые девушки, которые только обнаружили начало дегенеративных процессов кожи, могут значительно «затормозить» процесс старения при помощи данной методики.
Современные косметологические процедуры помогают максимально оттянуть пластическую операцию, а в некоторых случаях даже избежать ее.
Процесс подготовки к процедуре
Если сравнивать коррекцию лица филлерами с операцией, то она имеет гораздо меньше противопоказаний. Однако даже к столь малоинвазивной процедуре нужно готовиться особенно тщательно. Перед тем как делать лифтинг, доктор должен полностью убедиться, что у пациента нет никаких противопоказаний, к которым относятся:
- наличие заболеваний сердечно-сосудистой системы и свертываемости крови;
- систематический прием антикоагулянтных препаратов;
- инфекционные заболевания в стадии активности;
- наличие повышенной температуры тела;
- беременность и период лактации;
- дерматологические заболевания или нарушение целостности кожного покрова в области введения инъекций;
- психологические и психические расстройства;
- серьезные заболевания дыхательных путей, например, эпилепсия;
- склонность к образованию келоидных рубцов.
После того как врач убедится, что у пациента нет никаких противопоказаний, назначается дата проведения подтяжки. Доктор может сделать фото до и после лифтинга с позволения пациента, чтобы по истечению реабилитационного периода наглядно продемонстрировать результаты.
Перед самой процедурой маркером делается разметка, по которой будут вводиться филлеры. Далее кожа обрабатывается антисептиком и обезболивающим гелем, чтобы коррекция недостатков была максимально комфортной. Процесс введения инъекций занимает от 30 до 60 минут, после этого пациент сразу же может отправляться домой.
Особенности реабилитационного периода
Как правило, все видимые следы от процедуры проходят спустя 2-3 дня. Тем пациентам, которые не знают, как проводится подтяжка, рекомендовано посмотреть видео, чтобы понимать, чего ожидать от похода к врачу. На 2 недели после векторного лифтинга рекомендовано отказаться от посещения сауны и бассейна, также не желательно загорать в солярии или на улице. Если есть необходимость, процедуру проводят еще 2 раза с промежутком в 1 месяц между каждой.
Несмотря на безопасность манипуляции, могут появиться некоторые побочные эффекты. В области проколов нередко формируются маленькие синяки, а на лице появляются отеки. Это вполне естественный процесс, так как гиалуроновая кислота притягивает молекулы воды. Припухлость спадает на 2-3 день полностью, и пациент может возвращаться к нормальной жизни.
Отзывы и результаты женщин, которые испробовали на себе векторный лифтинг, подтверждают, что процедура переносится очень хорошо, как и период восстановления после нее. При условии правильного ухода за кожей и здорового образа жизни эффект сохраняется на 1,5-2 года, после чего подтяжку филерами можно делать снова.
Выбирая специалиста, который будет корректировать ваше лицо, обратите внимание на уровень его квалификации и используемые препараты. Правильный выбор клиники и врача гарантирует вам стойкий и высокий результат от омоложения.
Глаза Векторные изображения PNG | Глаза, Глаза аниме, Голубые глаза Векторы в формате .AI .EPS
коллекция векторов человеческих глаз
2000 * 2000
векторных глаз
612 * 792
вектор черных глаз
1200 * 1200
как нарисовать простой вектор глаз
1200 * 1200
милый простой вектор мультфильм большие глаза клипарт
1200 * 1200
коллекция векторов человеческих глаз 2
2000 * 2000
иллюстрация красивого вектора шаблона символа глаза
4167 * 4167
голубого глаза женщины
1200 * 1200
эскиза вектора глаза или цветной иллюстрации
1200 * 1200
вектора карие аниме глаза брови материал глаза клипарт
1200 * 1200
красные глаза
1200 * 1200
голубые глаза брови векторный материал глаза клипарт
1200 * 1200
набор глаз мультфильм дизайн
1200 * 1200
нарисованные вручную глаза векторный материал
925 * 664
векторный логотип для ухода за глазами
5000 * 5000
мультфильм аниме глаза эмодзи элементы глаза клипарт
1200 * 1200
векторные глаза
1200 * 1200
синий мультфильм аниме вектор большие глаза глаза клипарт
1200 * 1200
векторные глаза
1200 * 1200
острые зеленые глаза векторные или цветные иллюстрации
1200 * 1200
человеческие глаза векторные или цветные иллюстрации
1200 * 1200
глаза клипарт простой милый векторный мультфильм глаза клипарт материал
1200 * 1200
векторный мультфильм аниме простые карие глаза брови материал глаза клипарт
1200 * 1200
тигровые глаза для дизайна футболки
4000 * 4000
3d смайлики любовь значок глаза вау эмоции
1200 * 1200
простой черный вектор мультфильм большие глаза материал глаза клипарт
1200 * 1200
черные ресницы крупным планом
1200 * 1200
монохромный женский глаз крупным планом
1200 * 1200
змея с одним глазом векторная иллюстрация
5000 * 5000
приветствие в день независимости Индии с логотипом в виде флага и типографикой
5000 * 5000
глаза маа дурги хэппи и пуджа
5000 * 5000
глаз s клипарт вектор мультфильм глаза клипарт элементы
1200 * 1200
ресницы
1200 * 1200
мультфильм аниме милые круглые большие глаза материал для бровей глаза клипарт
1200 * 1200
один глаз иллюстрация
5000 * 5000
maa ashce bangla типографика с глазом
1200 * 1200
глаза клипарт вектор мультфильм глаза элементы
1200 * 1200
мультфильм милые круглые глаза материал глаза клипарт
1200 * 1200
логотип с одним глазом
800 * 800
зрачок черный
1200 * 1200
ресницы клипарт мультфильм материал для глаз
1200 * 1200
иллюстрации красных грибов таяние глаз
1200 * 1200
значок с одним глазом, векторная иллюстрация
90 003 5000 * 5000вектор значок глаза
1024 * 1024
мультфильм милые большие глаза выражение
1200 * 1200
милый коричневый мультфильм большие глаза глаза клипарт
1200 * 1200
муравей клипарт большие глаза милый красный муравей
1200 * 1200
черный глаз эскиз фон бесплатный шаблон дизайна логотипа
4167 * 4167
леопардовые глаза векторный дизайн футболки
4000 * 4000
милый испуганный открытые глаза чат смайликов
1201 * 1201
вектор глаз клипарт мультфильм животное черные большие глаза материал
1200 * 1200
зомби иллюстрации тают глаза
5000 * 5000
череп монстра один глаз вектор иллюстрация
5000 * 5000
кошачий глаз мультфильм значок дизайн вектор шаблон
2000 * 2000
третий глаз с руками и загадочный элемент лунного солнца
2000 * 2000
абстрактный сглаз и загадочный элемент солнца
2000 * 2000
линза голубого глаза сияющий круг
3000 * 3000
коллекция векторов человеческих глаз 3
2000 * 2000
нарисованные вручную тонкие вьющиеся длинные ресницы
1200 * 1200
дама с вектором иллюстрации голубых глаз на белом фоне
1200 * 1200
красный волк логотип для игровой команды
2500 * 2500
эзотерический треугольник иллюминатов дизайн глаз
1200 * 1200
значок глаза графический дизайн шаблон вектор
4167 * 4167
глаза несчастного человека, покрывающего его глаза рука отрицательная эмоция стресс неудача депрессивное лицо
4500 * 4500
один глаз монстр плавить хэллоуин
5000 * 5000
простой мультфильм вектор овал большие глаза глаза клипарт
1200 * 1200
3d реалистичные глаза открытые слезы женские смайлики современные смайлы смайлики грустное лицо
5000 * 5000
ресницы и брови составляют вектор дизайна логотипа для салона красоты
1200 * 1200
иллюстрации ужасов галактики глаз
5000 * 5000
жуткие глаза Хэллоуин страшная коллекция глазного яблока, изолированные на белом фоне мультфильм зомби-монстр с красным и зеленым которые вырезают вам украшения для вечеринок ужасов
1200 * 1200
макияж для лица материал для ресниц клипарт
1200 * 1200
красивые глаза богини Дурги для пуджи
5000 * 5000
милые смайлики в любви с фасонными глазами
2000 * 2000
Выступающие глаза, негатив Вектор, круглые глаза и имплантаты подглазничного края
Скелет верхней части средней зоны лица имеет прямое и косвенное влияние на внешний вид лица и, в частности, глаз.Отношение между глазным яблоком и краями глазницы будет определять, будут ли глаза выглядеть выпуклыми или глубоко посаженными. Поскольку подглазничный край (кость непосредственно под глазом) и верхний скелет средней зоны лица поддерживают нижние веки и мягкие ткани щек, их выступ влияет на положение век и щек. Пациенты с плохо выступающим скелетом средней зоны лица более склонны к преждевременному опусканию нижних век и щек с возрастом. Отсутствие опоры для скелета предрасполагает к неправильному положению нижних век после блефаропластики и ограничивает эффективность и продолжительность лифтинга средней зоны лица.Увеличение подглазничного края само по себе или вместе с другими манипуляциями с мягкими тканями может оказать сильное влияние на внешний вид периорбитальной области.
ОТНОШЕНИЯ ГЛОБ-RIM
Отношение земного шара к краям орбиты является основным фактором, определяющим внешний вид верхней трети лица. Нормальные значения показаны на рисунке.
В среднем, поверхность мягких тканей, покрывающих надглазничный край, лежит на 10 мм впереди роговицы, а поверхность мягких тканей, покрывающих подглазничный край, лежит на 3 мм позади передней поверхности роговицы. Это означает, что надглазничный край обычно выступает на 13 мм за пределы подглазничного края. Когда орбитальные края имеют больший выступ за переднюю поверхность роговицы, глаза выглядят «глубоко посаженными». Когда орбитальные края выступают меньше, глаза выглядят «выступающими». Из-за предрасположенности к проблемам, связанным с обнажением роговицы, чрезмерно выпуклые глаза обычно считаются менее привлекательными. Измерения от земного шара до орбитального обода имеют широкий диапазон, зависят от этнической принадлежности и пола и меняются с возрастом.
Старение
Pessa et al. ( Aesthetic Plast Surg . 23: 337, 1999.) показали, что отношение земного шара к краю орбиты меняется с возрастом. Они изучили две группы людей, молодых и старых, с помощью трехмерной компьютерной томографии. Их результаты кратко изложены на рисунке ниже.
На молодом лице щечный жир располагается кпереди от роговицы, а глазничный жир — немного впереди от края глазницы. С возрастом масса щеки имеет тенденцию располагаться кзади от передней поверхности роговицы, глазничный жир немного смещается. anterior, а подглазничный край имеет значительное движение кзади.Следовательно, ретрузия подглазничного края с возрастом сделает глаза более заметными из-за изменения соотношения глазного яблока и края глазного яблока, и это значительно повлияет на внешний вид мешков нижнего века, особенно у тех, у кого скелет средней части лица плохо выступает.
Блефаропластика
Относительное выступание глаз влияет на положение и форму нижнего века и, следовательно, является важным фактором при эстетической блефаропластике. Пластические хирурги давно признали, что пациенты с выпуклыми глазами предрасположены к опусканию нижнего века, которое может быть преувеличено. и симптоматический после традиционной блефаропластики.Выступление глаз является результатом недостаточности скелетной опоры, как уже обсуждалось, но может также быть результатом превышения объема мягких тканей орбиты. Выступление глаз коррелирует с более низким положением нижнего века (что приводит к склеральному выступу) и более медиальным положение бокового угла глазной щели. Опускание нижнего века увеличивает высоту глазной щели, в то время как более медиальное положение бокового угла глазной щели уменьшает ее ширину. Следовательно, пациенты с плохо выступающим скелетом верхней средней части лица имеют «круглые глаза» по сравнению с длинными узкими глазами, характерными для молодых людей с нормальной периорбитальной морфологией.Кроме того, у людей с недостаточным скелетом отсутствие выступа подглазничного края и выступа щек часто позволяет видеть жировые компартменты нижнего века, что дает им «ранние мешки»
Отрицательный вектор
У пациентов с выпуклыми глазами давно выявлено развитие симптомов опускания нижних век (с преувеличением их «круглых глаз») после традиционной нижней блефаропластики. Джелкс категоризировал отношения глазного яблока и орбиты и тенденцию к развитию нижних век. неправильное положение после блефаропластики.
На сагиттальной проекции они поместили линию или «вектор» между самой передней проекцией земного шара и скуловым возвышением и краем века. «Положительные» векторные отношения существуют, когда самая передняя проекция земного шара находится кзади от края века и скулового возвышения. «Отрицательная» векторная взаимосвязь существует, когда самая передняя проекция глазного яблока лежит кпереди от нижнего века и скулового возвышения. Они предупредили, что пациенты, морфология орбиты которых имеет отношения отрицательных векторов предрасположены к неправильному положению век после нижней блефаропластики.
Обращение отрицательного вектора
Увеличение подглазничного края у пациентов с ретрузивным подглазничным краем может улучшить его взаимоотношение с глазным яблоком, тем самым «обращая вспять отрицательный вектор».
Увеличение орбитального края имплантатами является частью стратегии нормализации внешнего вида пациентов с отрицательным вектором. Его можно адаптировать для пациентов с «отрицательным вектором», которые в первую очередь ищут улучшения своего периорбитального внешнего вида, или для тех, у кого есть отрицательный вектор. неправильное положение век и округлый вид глаз были преувеличены предыдущей нижней блефаропластикой.
ИНФРАОРБИТАЛЬНАЯ АУГМЕНТАЦИЯ И БЛЕФАРОПЛАСТИКА
Пациенты с гипопластическим краем глазницы имеют тенденцию к преждевременному старению. Недостаток скелетной опоры для мягких тканей нижнего века и средней части лица приводит к их раннему опусканию с сопутствующим округлением глазной щели и отсутствием отчетливой границы раздела щека-век. Пациенты с такой морфологией лицевого скелета склонны к дальнейшему опусканию нижнего века, которое часто является симптоматическим, после блефаропластики. Лечение ретракции нижнего века после блефаропластики у пациентов с отрицательными переносчиками век получило мало внимания в литературе.
Внешний вид пациентов с гипоплазией подглазничных краев («морфологически предрасположенный», «отрицательный вектор») можно нормализовать с помощью процедуры, сочетающей увеличение подглазничного края, поднадкостничное поднятие средней зоны лица и, при необходимости, латеральную кантопексию. Аллопластический имплант увеличивает сагиттальную проекцию подглазничного края, эффективно обращая вспять отрицательный вектор. Имплант обеспечивает поддержку тканей щеки и века. Поднятие средней зоны лица перемещает опущенную щеку и задействует ткань нижнего века, как показано на изображении поперечного сечения ниже.
Боковая кантопексия перемещает латеральный угол глазной щели и обеспечивает дополнительную поддержку нижнему веку. Эта операция может быть адаптирована для морфологически предрасположенных пациентов, которые в первую очередь хотят улучшить внешний вид периорбитальной области, или для тех, чье неправильное положение век и вид круглых глаз были преувеличены предыдущей нижней блефаропластикой.
У пациентки, показанной ниже, отрицательный вектор был изменен с помощью имплантата подглазничного края и поднадкостничной подтяжки средней зоны лица.Обратите внимание на увеличенную проекцию средней зоны лица.
Как рисовать вектор ГЛАЗ | Adobe Illustrator Tutorial
Как рисовать векторные глаза | Учебное пособие по Adobe Illustrator | LadyoakОрганизуйте и делитесь тем, что вам нравится.
Связанные контакты
Adobe Illustrator CC — Учебное пособие по … Adobe Illustrator CC — ластик, карандаш, следопыт… Как создать любой логотип, используя метод сетки »вики полезно … КАК СОЗДАТЬ ШАБЛОН | Adobe Illustrator Тут … Учебное пособие по Adobe Illustrator для начинающих: создание б … Дизайн логотипа в Illustrator cc || Иллюстратор Ло… Как создать шаблон фирменного бланка в Adobe il … учебник по векторному дизайну | Учебник по иллюстратору … Полный курс ИЛЛЮСТРАТОРА для ИНИЦИАНТОВ И … Учебное пособие по Adobe Illustrator: Дизайн ESport / S… Руководство по преобразованию векторных изображений в Adobe Illustrator CS6 … иллюстратор Учебник Апельсиновый сок Векторный логотип D … Изучите дизайн мандалы, шаг за шагом | Adobe Illus … Учебное пособие по Illustrator CC | Adobe Illustrator | S… Как создать профессиональную визитку в больнице … Adobe Illustrator Gaming Jersey Репетитор по дизайну … Как создавать изометрические фигуры в Adobe Illustrator Как разрезать / разрезать круг пополам в Illustrato… Учебное пособие по Adobe Illustrator CC — Как сделать … Adobe Illustrator — Типы масок — … Создавайте простые линейные буквенные логотипы с помощью Illustrator Как равномерно распределить объекты | Иллюстратор… Adobe Illustrator CC Учебное пособие по плоскому дизайну ̵ … Учебное пособие по Adobe Illustrator для начинающих — Создание … Как создать перспективный текст в Illustrator Учебное пособие по Illustrator CS5: Базовый цикл Desi… Как сделать эффект прожектора в Adobe Illustrat … Инструмент столбчатого графика (учебник по Illustrator) Инструкции Учебное пособие по Adobe Illustrator — Винтажный логотип … Как сделать современный узор середины века в Ado…Вам необходимо включить Javascript.
Познакомьтесь с нашей командой офтальмологов в Калгари
Доктор Джейми Бхамра — офтальмолог с повышенным уровнем подготовки в области хирургии катаракты и роговицы, включая рефракционную хирургию, кросслинкинг роговицы, внешние заболевания, заболевания глазной поверхности и синдром сухого глаза. Он занимается комплексной офтальмологией в Калгари, Альберта.
Родом из Ферни, Британская Колумбия, Калгари был легким выбором для продолжения обучения после окончания средней школы.Он получил степень бакалавра и доктора медицины в Университете Калгари. Аспирантура по офтальмологии прошла в Канаде и США. Резидентура по офтальмологии проходила в престижном Глазном институте Оттавского университета. Доктору Бхамре посчастливилось получить стипендию во всемирно известном Фонде Проктора и Калифорнийском университете в Сан-Франциско. Его специализированная подготовка включает роговицу, внешние болезни, рефракционную хирургию и увеит.
Др.Кропотливая, всесторонняя и сострадательная манера Бхамры в медицинском и хирургическом лечении нравится всем его пациентам. Он предлагает новейшие технологии интраокулярных линз, включая торические, аккомодационные и мультифокальные ИОЛ. Его квалифицированный, профессиональный и теплый подход проявляется в отличных результатах и заботе, которыми наслаждаются его пациенты. Он провел тысячи операций по удалению катаракты (на национальном и международном уровнях), и доктор Бхамра любезно стал одним из самых занятых хирургов по лечению катаракты в Альберте и Канаде.
Для пациентов с кератоконусом, прозрачной краевой дегенерацией и пострефракционной эктазией д-р Бхамра применяет новейшие технологии перекрестного сшивания роговицы. Он также хорошо разбирается в новейших технологиях трансплантации, включая проникающую кератопластику (PK), переднюю пластинчатую кератопластику (ALK), глубокую переднюю пластинчатую кератопластику (DALK), автоматическую эндотелиальную кератопластику с десцеметовой очисткой (DSAEK), ультратонкую десцеметовую автоматическую эндотелиальную кератопластику. кератопластика (UT-DSAEK), эндотелиальная кератопластика десцеметовой мембраны (DMEK) и кератопротезирование роговицы, а также различные комбинированные процедуры.
Доктор Бхамра также имеет опыт многих других процедур на поверхности глаза. К ним относятся хирургия птеригиума (с аутотрансплантацией), удаление поражений роговицы / конъюнктивы, трансплантация амниотической мембраны, а также различные ручные и автоматизированные кератотомии.
Он регулярно представляет исследования на местных, национальных и международных встречах офтальмологов, чтобы помочь коллегам-офтальмологам понять, интегрировать и предложить технологии для квалифицированных пациентов в их практике. Он провел отмеченные наградами исследования в области кросслинкинга роговицы и эндотелиалита роговицы, а также поделился своим мнением в области рефракционной хирургии, хирургии катаракты, ИОЛ премиум-класса, хирургии катаракты с помощью фемтосекундного лазера и эктазии роговицы.Его приглашали писать статьи о хирургии катаракты, заболеваниях роговицы и синдроме сухого глаза в нескольких рецензируемых журналах.
Он активно участвует в обучении ординаторов офтальмологов через его членство в Программе обучения ординатуры офтальмологов Университета Калгари. Доктор Бхамра участвует в проведении обучающих семинаров для офтальмологов, оптометристов, офтальмологов, семейных врачей, врачей скорой помощи, фармацевтов и ординаторов. Он был удостоен награды «Мастер-преподаватель» по программе офтальмологии Университета Калгари за отличное преподавание.Доктор Бхамра получил признание как превосходный и квалифицированный лектор на других факультетах Университета Калгари. Он также был выбран в качестве нового лидера канадской офтальмологии.
Международная офтальмология интригует и волнует доктора Бхамры. Он участвовал в офтальмологических лагерях и офтальмологических больницах по всему миру. От офтальмологической больницы Срикиран, Какинада, Индия, до помощи в медицинских и хирургических офтальмологических лагерях во Вьетнаме, он надеется продолжить обучение, преподавание и оказание помощи в рамках программ помощи.В организации Better World Canada он и его жена помогли организовать и провести несколько медицинских офтальмологических лагерей в сельских районах Кении. Все потрясающие впечатления.
Доктор Бхамра связан со многими офтальмологическими ассоциациями, включая Королевский колледж врачей и хирургов Канады, Канадскую медицинскую ассоциацию, глазных врачей и хирургов Альберты, глазное общество Фредерика К. Кордеса, Американское общество катаракты и рефракции, Американскую академию офтальмологии. , Колледж врачей и хирургов Альберты, Канадский институт катаракты, Канадское офтальмологическое общество, Медицинская ассоциация Альберты, Общество рефракционной хирургии и Общество роговицы.
Доктор Бхамра увлекается фитнесом, йогой, медитацией, хоккеем и гольфом. Ему и его семье нравится путешествовать по миру и делать как можно больше фотографий! Он счастлив и рад быть частью замечательной заботливой команды Vector Eye Center и с нетерпением ждет возможности предложить всем такой же превосходный уход.
Инъекция генной терапии в один глаз удивляет ученых, улучшая зрение в обоих
В ходе знаменательного этапа 3 клинических испытаний международная группа под руководством доктора Патрика Ю-Вай-Мана из Кембриджского университета и доктора Жозе-Алена Сахеля из Университет Питтсбурга и Institut de la Vision в Париже успешно вылечили 37 пациентов, страдающих наследственной оптической нейропатией Лебера (LHON).При условии проведения дальнейших испытаний, лечение может помочь тысячам людей во всем мире восстановить и частично сохранить зрение.
Исследование, опубликованное сегодня в журнале Science Translational Medicine , показывает, что 78% пролеченных пациентов испытали значительное улучшение зрения на оба глаза. Это предполагает, что улучшение зрения на необработанных глазах могло быть связано с переносом вирусной векторной ДНК из инъецированного глаза.
LHON влияет на определенный тип клеток сетчатки, известный как ганглиозные клетки сетчатки, вызывая дегенерацию зрительного нерва и быстрое ухудшение зрения обоих глаз.В течение нескольких недель после начала болезни зрение большинства пострадавших людей ухудшается до уровней, при которых они считаются юридически слепыми. Восстановление зрения происходит менее чем в 20% случаев, и лишь немногие из них достигают лучшего зрения, чем 20/200 (самая большая буква на стандартной диаграмме зрения). LHON поражает примерно 1 из 30 000 человек, в основном мужчин, причем симптомы обычно появляются в возрасте от 20 до 30 лет. Большинство пациентов являются носителями мутации m.11778G> A в гене MT-ND4. Существующие методы лечения этой слепящей оптической нейропатии остаются ограниченными.
«Как человек, лечащий этих молодых пациентов, я очень расстроен отсутствием эффективных методов лечения», — сказал старший исследователь доктор Сахель, профессор офтальмологии в Университете Питтсбурга. «Эти пациенты быстро теряют зрение в течение от нескольких недель до пары месяцев. Наше исследование дает большие надежды на лечение этой болезни, вызывающей слепоту, у молодых людей ».
Исследователи вводили rAAV2 / 2-ND4 — вирусный вектор, содержащий модифицированную кДНК — в полость стекловидного тела на задней стороне одного глаза 37 пациентов, которые страдали потерей зрения от 6 до 12 месяцев.В другой глаз им сделали фиктивную инъекцию. Технология, называемая митохондриальным нацеливанием, была разработана Institut de la Vision в Париже, Франция, и лицензирована GenSight Biologics.
Международный исследователь-координатор и нейроофтальмолог доктор Ю-Вай-Ман из Кембриджского отделения клинической неврологии и глазной больницы Мурфилдс, Лондон, сказал: «Мы ожидали улучшения зрения в глазах, обработанных только вектором генной терапии. Довольно неожиданно, улучшение состояния обоих глаз у 78% пациентов в исследовании продолжалось по той же траектории в течение 2 лет наблюдения.”
Обработанные глаза показали среднее улучшение остроты зрения с наилучшей коррекцией (BCVA) на 15 букв на диаграмме ETDRS, представляющей три линии зрения, в то время как среднее улучшение на 13 букв наблюдалось в искусственно обработанных глазах. Поскольку некоторые пациенты все еще находились в динамической фазе процесса болезни после включения в исследование, визуальный эффект от надира (худший BCVA для каждого глаза) был еще больше, достигнув 28,5 букв для обработанных глаз и 24,5 букв для глаз, подвергнутых искусственной обработке.
Доктор Ю-Вай-Ман сказал: «Заменяя дефектный ген MT-ND4, это лечение спасает ганглиозные клетки сетчатки от деструктивного воздействия m.11778G> Мутация, сохраняющая функцию и улучшающая зрительный прогноз пациента. Результаты могут изменить жизнь ».
Исследователи обнаружили, что обработанные глаза примерно в три раза чаще имеют зрение лучше или равное 20/200. Показатели исхода, сообщаемые пациентами, оцениваемые с помощью опросника по зрительным функциям Национального института глазных болезней 25 (NEI VFQ-25), также подтверждали положительное влияние лечения на качество жизни и психосоциальное благополучие.
Затем исследователи провели исследование на яванских макаках, чтобы выяснить, как лечение одного глаза может улучшить состояние другого.У макак зрительная система похожа на человеческую, что позволяет гораздо более детально изучить распространение и эффекты вектора для генной терапии. Была введена односторонняя инъекция rAAV2 / 2-ND4, и через три месяца ткани из различных частей глаза и мозга были проанализированы для обнаружения и количественной оценки присутствия ДНК вирусного вектора с использованием трансген-специфичного количественного анализа ПЦР.
ДНК вирусного вектора была обнаружена в переднем сегменте, сетчатке и зрительном нерве необработанного глаза.Неожиданное улучшение зрения, наблюдаемое на необработанных глазах, могло отражать межглазную диффузию rAAV2 / 2-ND4. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить эти выводы и выяснить, способствуют ли этому двустороннему улучшению другие механизмы.
Доктор Ю-Вай-Ман сказал: «Спасение зрения с помощью генной терапии стало реальностью. Доказано, что лечение безопасно, и в настоящее время мы изучаем оптимальное терапевтическое окно ».
«Наш подход не ограничивается только восстановлением зрения», — добавил д-р Сахель.«Другие митохондриальные заболевания можно лечить с помощью той же технологии».
Банкноты
rAAV2 / 2-ND4 (GS010) представляет собой рекомбинантный дефектный по репликации аденоассоциированный вирус серотипа 2, который содержит модифицированную кДНК, кодирующую митохондриальный белок ND4 дикого типа человека, и специфическую митохондриальную целевую последовательность (MTS) для направления белка. в митохондриальный компартмент.
Диаграмма ETDRS состоит из строк по 5 букв в каждой и используется для измерения остроты зрения.
Финансирование
Исследование было полностью профинансировано и спонсировано GenSight Biologics.
Номер ссылки
Патрик Ю-Вай-Ман и др., «Двустороннее улучшение зрения с помощью односторонней инъекции генной терапии при наследственной оптической невропатии Лебера»; Научная трансляционная медицина (9 декабря 2020 г.). DOI: 10.1126 / scitranslmed.aaz7423
аденовирусных векторов, нацеленных на разные типы клеток сетчатки
Потеря любого из множества типов клеток, обнаруженных в сетчатке, может привести к слепоте, второму наиболее опасному состоянию после рака среди американцев.Сетчатка человека представляет собой слоистую ткань, состоящую из светочувствительных фоторецепторов во внешней сетчатке, которые модулируют ток со сложным набором внутренних нейронов сетчатки. Фоторецепторы полагаются на соседний пигментный эпителий сетчатки (RPE) для генерации и рециркуляции retinal (витамин A), хромофора, который поглощает свет, чтобы инициировать каскад фототрансдукции, который в конечном итоге воспринимается как зрение. Нейроны сетчатки поддерживаются глии Мюллера, которые обеспечивают критически важную поддержку для поддержания и функционирования сетчатки.
Потеря клеток RPE характерна для возрастной дегенерации желтого пятна (AMD), наиболее частой причины слепоты у пожилых людей в Соединенных Штатах. 1 Потеря фоторецепторов может привести к пигментному ретиниту (РП), наиболее частой причине наследственной слепоты у работающего населения, затрагивающей примерно 1 из 3000 человек. 2 Редкое наследственное заболевание, называемое дистрофией клеток Мюллера, вызвано первичной дисфункцией клеток Мюллера. 3 Следовательно, существует значительная потребность в векторах для переноса генов, которые эффективно трансдуцируют каждый из различных типов клеток сетчатки. На сегодняшний день все векторы для переноса генов, вводимые во внешнюю сетчатку, в область, называемую субретинальным пространством, в первую очередь инфицируют РПЭ. Однако посредством модификаций вектора, таких как псевдотипирование или делеция интегрин-связывающих мотивов в вирусных капсидах, другие типы клеток сетчатки, такие как фоторецепторы, также могут трансдуцироваться, хотя и не так эффективно, как RPE.
Аденовирус человека (Ad) ранее использовался в двух клинических испытаниях глазных болезней без каких-либо серьезных побочных эффектов. 4 , 5 Кратковременную экспрессию трансгена, обычно наблюдаемую в аденовирусных векторах, можно преодолеть с помощью хелпер-зависимых аденовирусных векторов. 6 — 8 Таким образом, четкое понимание тропизма различных серотипов аденовируса в сетчатке значительно повысило бы прогресс в исследованиях опосредованной аденовирусом генной терапии глаза.Аденовирус серотипа 5 (Ad5) инфицирует клетки путем первоначального связывания белка волокна аденовируса с мембранно-ассоциированным рецептором аденовируса Коксаки (CAR) с последующей интернализацией вируса посредством взаимодействия между мотивом RGD в основании пентона аденовируса с α v β 3/5 интегринов. 9 — 11 Напротив, было показано, что волокна Ad35 и Ad37 взаимодействуют с CD46 и сиаловой кислотой соответственно. 12 , 13 Ранее было показано, что трансдукция фоторецепторов может быть усилена либо удалением мотива RGD в основании пентона, либо заменой волокна Ad5 волокном Ad35 или Ad37. 14 — 16
Хотя в каждом из этих исследований описывается улучшенная трансдукция фоторецепторов, данные этих исследований нельзя сравнивать напрямую из-за использования различных генов, промоторов или методов обнаружения трансгенов. Следовательно, относительная эффективность между этими векторами все еще остается без ответа и актуальным вопросом для продвижения ад-опосредованной генной терапии сетчатки. Одна из целей настоящего исследования состояла в том, чтобы сравнить эффективность этих различных аденовирусных векторов в условиях, которые позволяют их прямое сравнение в сетчатке, т.е.е. использование одной и той же комбинации трансгена и промотора и аналогичного метода обнаружения наличия продукта гена. Вторая цель этого исследования состояла в том, чтобы использовать наиболее эффективный вектор, идентифицированный здесь, для попытки экспрессии фоторецептор-специфичного трансгена в сетчатке посредством использования клеточно-специфичных промоторов. Существенная экспрессия трансгена, специфичного для фоторецепторов, до сих пор не описана с использованием аденовирусных векторов. Наши результаты и выводы значительно отличаются от результатов предыдущих исследований и, следовательно, подчеркивают необходимость продолжения оценки тропизма аденовирусов в сетчатке до их продвижения в клинику.
Материалы и методы
Клеточные линии
Клеточные линии HEPA 1c1c7, Y79 и 293 были получены из АТСС (Манассас, Вирджиния). Реагенты для клеточных культур были приобретены у Invitrogen Life Technologies (Карлсбад, Калифорния). Клетки (293 и 911) 17 поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) / 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки HEPA 1c1c7 в αMEM / 10% FBS и клетки Y79 в RPMI 1640 с добавлением 1-глутамина, d-глюкозы, пирувата Na (1 мМ) и 15% FBS.
Рекомбинантные конструкции аденовируса
Гибридное волокно 5/35 амплифицировали с помощью ПЦР с плазмиды Ad5 / F35 (полученной от Андре Либера, Вашингтонский университет). Используя праймеры AdE28403F (5 ‘TATTCAGCAGCACCTCCTTGCC 3’) и AdE30702R (5 ‘ATGTAGGCGTGGACTTCTCCTTCG 3’), получили продукт размером 1,4 т.п.н. Затем фрагмент Age1 / Mfe1 длиной 842 п.н. клонировали в расщепленную Age1 / Mfe1 p6.2FIB 18 с образованием p6.2FIBF35. Фрагмент Pac1 / Srf1 размером 4,9 т.п.н. р6.Затем 2FIBF35 клонировали в аналогично расщепленный Adeasy1 19 для создания pAdEasyF35. Затем это было рекомбинировано с pShCAGGFP 14 для генерации AdF35CAGGFP. AdF37CAGGFP был получен путем рекомбинации pShCAGGFP и pAd5F37. 18
Ad5CAGGFPΔRGD было описано ранее. 14 Вектор Ad5sRhoGFPΔRGD был получен с использованием аналогичной стратегии. Промотор опсина мыши длиной 257 п.о. амплифицировали с помощью ПЦР из SB6.25 (подарок Вольфганга Бэра, Университет Юты) с использованием праймеров sRHO-F (5′-CCCAGATCTCCCGAATTCCCAGAGGACTCTGG-3 ‘) и sRHO-R (5′-CCCGTCGACCCCGGCGAGCTCAGCCACTGAC-3’). Продукт ПЦР расщепляли Bgl II / Sal I и клонировали в соответствующие сайты pShGFP. 14 Полученная плазмида была названа pShsRhoGFP. Он был рекомбинирован с pAdeasyΔRGD 14 для получения Ad5sRhoGFPΔRGD. Ad5F37 и Ad5ΔRGD были сконструированы с использованием системы AdEasy 19 и были описаны ранее. 14 , 18
Во всех случаях аденовирус был выделен в 293 клетках, как описано ранее. 18 Вирусы очищали с использованием набора для очистки (Adenopure; Puresyn, Inc., Малверн, Пенсильвания) и концентрировали с использованием фильтра 100 кДа (Millipore, Billerica, MA). Титры вирусов определяли с использованием масс-спектрофотометра при 260 нм (DU530 UV / Vis; Beckman Coulter, Hialeah, FL).
Вестерн-блот-анализ
Вирусные частицы (5 × 10 9 ) суспендировали в 50 мкл 100 мМ трис-HCl, 0.5 M NaCl, 0,1% SDS и 10% Triton X-100, содержащие лейпептин (10 мкг / мл), апротинин (10 мкг / мл) и фенилметилсульфонилфторид (1 мМ). Образцы наносили на 10% -ный трис-глицин-полиакриламидный гель в денатурирующих условиях. Белок волокна детектировали с использованием моноклонального антитела Ab-4 (клон 4D2; Neomarkers, Фремонт, Калифорния) в концентрации 1: 1000, затем козьих антимышей, конъюгированных с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch, Bar Harbor, ME). антитело.
Трансфекция и блокирование CD46 in vitro
pBluescript, содержащая человеческую кДНК CD46, была получена из АТСС (MGC-26544).КДНК высвобождали расщеплением Eco RI и Ssp I и клонировали в pCAGEN, расщепленную Eco RI / Eco RV (подарок Конни Сепко), для получения pCAGCD46. pCAGntLacZ получали путем вставки фрагмента Not I pBntLacZ (pBluescript, содержащего кДНК LacZ) в pCAGEN, расщепленную Not I. Шесть микрограммов pCAGENCD46 или pCAGntLacZ трансфицировали в 1 × 10 5 клеток HEPA 1c1c7 с использованием реагента для трансфекции (Lipofectamine 2000; Invitrogen) и поддерживали в αMEM с добавлением 2% FBS при 37 ° C / 5% CO 2 для 48 часов.Затем клетки инфицировали либо Ad5CAGGFP (множественность заражения [MOI] 20), либо Ad5F35CAGGFP (MOI 750) в течение дополнительных 48 часов.
Блокирующие эксперименты
Клетки трансфицировали, как описано. Через 48 часов клетки обрабатывали либо 5 мкг / мл мышиных антител против человеческого CD46 (MEM258; Serotec, Raleigh, NC) для блокирования домена SCR1 CD46, либо кроличьими антителами против овечьих IgG (Jackson ImmunoResearch) в качестве неспецифического контроля в течение 30 дней. минут при 37 ° C / 5% CO 2 . Затем клетки инфицировали либо Ad5CAGGFP (MOI 20), либо Ad5F35CAGGFP (MOI 750), как описано.Экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) анализировали под микроскопом (IX51; Olympus, Токио, Япония) и с помощью проточной цитометрии (FACSCalibur; Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ).
Y79 Трансдукция клеток
Клетки (4,5 × 10 5 Y79) были инфицированы Ad5CAGGFP, Ad5F35CAGGFP, Ad5F37CAGGFP или Ad5ΔRGDCAGGFP при MOI 500. Инфицированные клетки поддерживали в среде RPMI при 37 ° C 5% 906 906 в течение 24 часов, после чего анализировали экспрессию GFP (FACSCalibur; Becton-Dickinson).
In vivo Transduction
Все исследования на животных проводились в соответствии с политикой, изложенной в Заявлении ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения, а также федеральными и государственными директивами. Если не указано иное, для каждой вирусной конструкции по меньшей мере шесть глаз 6-недельных мышей C57BL / 6J инъецировали 1 мкл, содержащим 1 × 10 9 вирусных частиц. Через 6 дней глаза собирали и фиксировали в 4% PFA.
Для анализа площади поверхности и эффективности вирусной трансдукции были взяты шесть глаз для каждой конструкции, роговица и хрусталик были удалены, глаза были разрезаны на квадранты и плоско закреплены на покровном стекле.Изображение каждого наглазника получали с помощью микроскопа (Nikon, Токио, Япония) и камеры (Olympus) в ярком поле и фильтра GFP (экспозиция 2,5 секунды). Для подготовки к количественному анализу все изображения были размером 600 × 450 пикселей с использованием программного обеспечения для редактирования графики (Photoshop; Adobe, Сан-Хосе, Калифорния). Площадь трансдукции рассчитывалась с использованием программного обеспечения ImageJ (разработанного Уэйном Расбандом, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд; доступно по адресу http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Процент площади трансдукции рассчитывали путем деления преобразованной области на общую площадь поверхности.Средняя флуоресценция преобразованной области была рассчитана путем преобразования изображения в оттенки серого и вычисления средней интенсивности пикселей с помощью ImageJ. Графики поверхности были получены с использованием функции плагина ImageJ, известной как интерактивные трехмерные графики поверхности.
Чтобы сравнить вирусную трансдукцию в сетчатке с RPE / сосудистой оболочкой, для каждой конструкции собирали шесть глаз, удаляли линзу и роговицу, а сетчатку отделяли от RPE / сосудистой оболочки. Сетчатку и РПЭ / сосудистую оболочку помещали отдельно 1.Пробирки объемом 5 мл и погружают в жидкий азот на 15 секунд. Глаза не визуализировались для GFP перед диссекцией, чтобы предотвратить УФ-повреждение и ускорить удаление сетчатки / RPE без деградации белка. РНК экстрагировали и очищали (набор RNeasy; Qiagen, Валенсия, Калифорния), а затем 3 мкг каждого образца обрабатывали ДНКазой (Turbo; Ambion, Остин, Техас). Образцы загружали в трех экземплярах для RT-PCR (Icycler IQ5; Bio-Rad, Hercules, CA) для обнаружения экспрессии GFP с использованием специального анализа EGFP, полученного от Applied Biosystems (Foster City, CA), с прямым праймером EGFP-ANYF (5 ‘-GAGCGCACCATCTTCTTCAAG-3′), обратный праймер EGFP-ANYR (5’-TGTCGCCCTCGAACTTCAC-3 ‘) и зонд EGFP-ANYM1 (5′-ACGACGGCAACTACA-3’).Все образцы были нормализованы по β-актину мыши (Applied Biosystems).
Чтобы проанализировать картину трансдукции в сетчатке, квадрант, содержащий область GFP, был вырезан из каждого плоского держателя, используемого для исследования трансдукции (см.), И встроен в ОКТ. Последовательные поперечные срезы 14 мкм были сделаны через весь квадрант, и были сделаны изображения (микроскоп BX51 [Olympus]; камера Retiga 2000R FAST [QImaging, Surrey, BC, Canada]; программное обеспечение QCapture Pro 5.0 [QImaging]). Время воздействия регулировали независимо для RPE и сетчатки для каждого вируса, чтобы оптимизировать визуализацию трансдуцированных типов клеток.
После субретинальной инъекции Ad5ΔRGD имеет более устойчивую экспрессию в сетчатке и RPE, чем Ad5, Ad5 / F35 и Ad5 / F37. ( A ) Плоские крепления, показывающие область трансдукции. ( B ) Процент наглазника, измеренный ImageJ, трансдуцированный каждым вирусом, варьируется незначительно. ( C ) Интенсивность экспрессии GFP, измеренная как интенсивность пикселей с использованием ImageJ, из Ad5ΔRGD значительно увеличивается по сравнению с Ad5, Ad5 / F35 и Ad5 / F37. ( D ) Анализ экспрессии GFP с помощью qRT-PCR показывает, что вирус Ad5ΔRGD способен экспрессироваться на более высоких уровнях в сетчатке, чем Ad5, Ad5 / F35 или Ad5 / F37.( E ) qRT-PCR экспрессии GFP показывает, что в RPE по сравнению с Ad5 как Ad5 / F35, так и Ad5 / F37 снижены, тогда как Ad5ΔRGD немного повышен. * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001.
Для определения доли трансдуцированных клеток во внутреннем ядерном слое (INL) и внешнем ядерном слое (ONL) по сравнению с общим количеством клеток для каждого слоя в Ad5ΔRGD, мы использовали модифицированный стереологический метод. Для анализа использовали 84 серийных среза размером 14 мкм, охватывающих трансдуцированную область.Флуоресцентные изображения были преобразованы в 8-битные и проанализированы с помощью программного обеспечения (StereoInvestigator версии 6.5.5.1; Micro BrightField, Williston, VT). Оптический диссекторный зонд использовался вместе с сеткой выборки 86,3 × 20 мкм и периодичностью выборки 10. Перед выборкой INL / ONL / RPE отслеживали вручную с использованием изображения в светлом поле для создания ROI для каждого раздела. Затем изображение в светлом поле использовалось для подсчета общего количества клеток, а флуоресцентное изображение использовалось для подсчета общего количества GFP-положительных клеток.Исходные данные (см.) Были автоматически рассчитаны программным обеспечением (StereoInvestigator версии 6.5.5.1; Micro BrightField) с использованием дисперсии CE Gundersen. Это дает высокие, средние и низкие оценки ячеек для каждого раздела. Коэффициент ошибки был автоматически оценен программным обеспечением в соответствии с методом Шаффера, который предназначен для расчета CE для точек данных, собранных из прослеженной области интереса, взятой из случайно выбранных областей через ткань неоднородной формы. Таким образом, кривизна ткани экстраполируется из изображений.
Клетки Мюллера трансдуцируются Ad5 / F37. ( A ) Срезы сетчатки, трансдуцированные Ad5 / F37, меченные антителом против CRALBP. Наблюдали градиент экспрессии CRALBP со сниженной экспрессией к центру области инъекции. Подавление генов, участвующих в каскаде фототрансдукции, наблюдалось ранее 31 после субретинальной инъекции. ( B ) Срезы сетчатки, трансдуцированные Ad5 / F37, меченные антителом к GFAP.
Иммуногистохимия
Клетки Y79 высевали с плотностью 4.5 × 10 5 клеток на предметных стеклах, покрытых поли-d-лизином (Becton-Dickinson), в течение 24 часов и были зафиксированы в 10% формалине в течение 15 минут перед окрашиванием. Срезы тканей фиксировали в 4% PFA, а затем пропускали через серию градуированных сахароз (15% и 30%) перед тем, как делить срезы на 14 мкм. Для определения сиаловой кислоты мы использовали биотинилированный лектин II Maackia amurensis (Mal II; Vector Laboratories, Burlingame, CA; 100 мкг / мл), а затем Cy3-конъюгированный стрептавидин (1 мкг / мл). Для обнаружения интегрина мы использовали mAb против интегрина альфа V (Transduction Laboratories; 1 мкг / мл), а затем Cy3-конъюгированные козьи антимышиные антитела (1 мкг / мл).Обнаружение CD46 было достигнуто с использованием мышиных антител к человеческому CD46 (20 мкг / мл; клон MEM-258; Serotec), а затем Cy3-конъюгированных козьих антимышиных антител (1 мкг / мл). Для обнаружения внеклеточной области CAR мы использовали кроличьи анти-CAR (1: 2000; подарок Джеффа Бергельсона, Университет Пенсильвании), а затем Cy3-конъюгированные козьи антикроличьи антитела (1 мкг / мл). Мы использовали два антитела для обнаружения клеток Мюллера. Мы использовали кроличий антиглиальный фибриллярный кислый белок (анти-GFAP; Novus Biologicals, Литтлтон, Колорадо), а затем Cy3-конъюгированный козий антикроличий белок (1 мкг / мл).Мы также использовали мышиные анти-CRALBP (Abcam, Cambridge, MA), а затем Cy3-конъюгированные козьи антимышиные антитела (1 мкг / мл). Окрашивание CRALBP проводили на замороженных срезах сетчатки размером 20 мкм, тогда как все остальные окрашивания проводили на срезах 14 мкм. Все отрицательные контроли были получены путем исключения первичного антитела.
Статистический анализ
Если не указано иное, эксперименты проводили в двух экземплярах не менее трех раз. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение от среднего. При необходимости, значимость рассчитывалась с использованием теста Стьюдента t , за исключением стереологических данных, для которых для определения коэффициента ошибки использовался метод Шеаффера.
Результаты
Аденовирусные векторы
Чтобы сравнить тропизм аденовирусов в сетчатке, мы исследовали эффективность четырех различных аденовирусных векторов, каждый из которых экспрессировал GFP под контролем промотора куриного β-актина / энхансера CMV / интрона кроличьего глобина. Ранее мы продемонстрировали, что этот промотор дает значительно большую экспрессию трансгена во всех слоях сетчатки и RPE по сравнению с промотором CMV. 14 В каждом векторе кассета экспрессии трансгена была клонирована в антисмысловой ориентации по отношению к удаленной области E1.Каждая векторная магистраль была основана на Ad5. Два вектора были модифицированы заменой волокна Ad5 на волокно Ad35 или Ad37, а в третьем векторе был удален мотив RGD (Arg-Gly-Asp) в основании пентона Ad5 (A). В дальнейшем каждый вектор обозначается как Ad5, Ad5 / F35, Ad5 / F37 и Ad5ΔRGD соответственно. Для подтверждения экспрессии и включения модифицированных волокон денатурированные образцы очищенных вирусных препаратов подвергали иммуноблоттингу с использованием антител, индуцированных против первых 17 аминокислот на N-конце волокна Ad5.Иммуноблоты коррелировали с предсказанными размерами согласно анализу аминокислотной последовательности для мономеров волокон денатурированных образцов Ad5 (64 кДа), Ad5 / F35 (35 кДа) и Ad5 / F37 (38 кДа; B). Тримеризация волокон наблюдалась в образцах, которые не были денатурированы для анализа вестерн-блоттингом, а также коррелировала с предсказанными размерами для Ad5 (192 кДа), Ad5 / F35 (105 кДа) и Ad5 / F37 (114 кДа).
Структура Ad5ΔRGD, Ad5 / F37 и Ad5 / F35. ( A ) Домен RGD удален в основании пентона Ad5ΔRGD.Гибридное волокно Ad5 / F37 состоит из первых 17 аминокислот волокна Ad5, за которыми следуют аминокислоты от 18 до 365 волокна Ad37 дикого типа и сигнал рА BGH. Гибридное волокно Ad5 / F35 состоит из первых 44 аминокислот волокна Ad5, за которыми следуют аминокислоты 132–991 волокна Ad35 дикого типа и сигнал рА Ad5 (а.о. 32775–33651). Кассету экспрессии EGFP клонировали в антисмысловой ориентации в область E1. Экспрессия управляется промотором куриного β-актина / энхансером CMV / интроном кроличьего глобина (CAG).( B ) Вестерн-блоттинг белков нативных и денатурированных волокон Ad5, Ad5 / F37 и Ad5 / F35 выявил ожидаемые размеры полос тример / мономер 192/64, 114/38 и 105/35 кДа соответственно. с использованием моноклонального антитела к удерживаемому N-концу волокна Ad5. ΔRGD, удаленные аминокислоты аргинин, глицин, аспарагиновая кислота; pA, полиА-хвост; LITR, левый перевернутый концевой повтор; RITR, правый перевернутый концевой повтор; Ψ, сигнал упаковки; MLT, основная поздняя стенограмма; E1 – E4, ранние области 1–4.
Вектор Ad5 / F35
Перед исследованием тропизма каждого из вышеуказанных векторов в сетчатке мы подтвердили, что каждый вектор связывает свой соответствующий рецептор в культуре клеток. Чтобы проверить, был ли наш новый вектор Ad5 / F35 перенаправлен с CAR на CD46, мы инфицировали мышиные клетки HEPA 1c1c7 либо Ad5, либо Ad5 / F35. MOI для каждого вектора корректировали для достижения GFP-положительной популяции клеток приблизительно 10%. Для Ad5 это было достигнуто при MOI 20, тогда как для Ad5 / F35 MOI 750 был необходим для той же частоты преобразования.Когда мышиные клетки HEPA 1c1c7 были предварительно трансфицированы кассетой, экспрессирующей человеческий CD46, инфицирование вирусом Ad5 / F35 увеличилось почти в три раза по сравнению с предварительной трансфекцией контрольной плазмидой, экспрессирующей LacZ. Напротив, уменьшение инфицирования вирусом Ad5 наблюдалось, когда клетки были предварительно трансфицированы CD46 человека по сравнению с lacZ (A). Мы также отметили, что одного процесса трансфекции (с помощью контрольной плазмиды) было достаточно для усиления заражения обоими вирусами, но трансфекция CD46 имела значительно больший эффект на Ad5 / F35, чем на Ad5.
ЭкспрессияCD46 усиливает трансдукцию клеток Ad5 / F35. ( A ) Трансфекция клеток HEPA 1c1c7 плазмидой, экспрессирующей CD46, улучшала трансдукцию Ad5 / F35, но не Ad5. ( B ) Предварительная трансфекция клеток HEPA 1c1c7 плазмидой, экспрессирующей CD46, с последующим блокированием антителом, которое связывается с внеклеточным доменом SCR1 CD46, снижает эффективность проникновения вирусных клеток Ad5 / F35. * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001.
Связывание волокон Ad35, как ранее было показано, происходит через короткие консенсусные повторяющиеся области 1 (SCR1) и 2 (SCR2) CD46. 20 Чтобы изучить связывание Ad5 / F35 с SCR1 / 2, мы предварительно инкубировали мышиные клетки HEPA 1c1c7 с антителом MEM258, которое, как известно, связывает SCR1. В качестве неспецифического контроля использовали кроличий анти-овечий IgG. Как описано, клетки также предварительно трансфектировали либо человеческой CD46, либо плазмидой, экспрессирующей lacZ. Мы обнаружили, что в то время как после блокирования CD46 с помощью MEM258 не было значительных изменений в инфицировании Ad5, инфицирование Ad5 / F35 уменьшилось более чем в два раза (B).Подробная характеристика вируса Ad5 / F37, используемого в этом исследовании, и, в частности, его способность использовать сиаловую кислоту в качестве рецептора, была описана нами ранее. 18
Предыдущие исследования показали, что CD46 экспрессируется на клетках ретинобластомы человека (Y79), что делает возможным эффективную трансдукцию этих клеток вирусами Ad5 / F35. 15 С помощью иммуногистохимии мы подтвердили, что клетки Y79 экспрессируют CD46 и сиаловую кислоту вместе с умеренными количествами CAR, но очень небольшими количествами интегрина α v (A).Клетки Y79 инфицировали при MOI 500 каждым рекомбинантным вирусом в течение 24 часов и анализировали на экспрессию GFP с помощью FACS. Доля клеток, экспрессирующих GFP для Ad5, Ad5 / F35, Ad5 / F37 и Ad5 / ΔRGD, составляла 10% ± 1%, 31% ± 2%, 2% ± 1% и 12% ± 1%. соответственно (Б). В совокупности эти данные предполагают, что наша рекомбинантная конструкция Ad5 / F35 связывает CD46 и эффективно трансдуцирует клетки, экспрессирующие CD46 на своей поверхности. Мы определили, что сиаловая кислота также экспрессируется на клетках Y79, однако Ad5 / F37 не трансдуцирует клетки Y79 эффективно, возможно, потому, что клетки Y79 экспрессируют очень мало интегрина, к которому вирусы Ad37, как было показано, обладают высокой аффинностью. 21 Интересно, что Ad5 и Ad5ΔRGD имели почти одинаковую эффективность трансдукции в клетках Y79.
Клетки ретинобластомы Y79 экспрессируют CD46 и более эффективно трансдуцируются Ad5 / F35, чем Ad5, Ad5 / F37 или Ad5ΔRGD. ( A ) Иммуноокрашивание показывает, что клетки Y79 экспрессируют CD46 и некоторое количество сиаловой кислоты, тогда как CAR и интегрин αv экспрессируются на очень низких уровнях. ( B ) FACS-анализ экспрессии GFP после инфицирования при MOI 500 показывает, что Ad5 / F35 более легко трансдуцирует клетки Y79, чем Ad5, Ad5 / F37 или Ad5ΔRGD.* P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01.
Исследования in vivo
Для изучения кинетики экспрессии трансгена каждой из вирусных конструкций в сетчатке in vivo 10 9 вирусных частиц были введены в субретинальное пространство 6-недельных мышей C57BL6J. Шесть дней спустя глаза были собраны, закреплены на плоской поверхности и количественно определены на флуоресценцию GFP с использованием программного обеспечения ImageJ. Распространение вируса через сетчатку измеряли как общую площадь GFP-положительной поверхности по отношению к площади поверхности всего наглазника.Трансдуцированная площадь для каждого вируса незначительно варьировалась, и для Ad5, Ad5 / F35, Ad5 / F37 и Ad5ΔRGD было определено, что она составляет 9% ± 1%, 5% ± 1%, 6% ± 1% и 9% ± 2% соответственно (А, Б). Средняя интенсивность пикселей GFP для Ad5, Ad5 / F35, Ad5 / F37 и Ad5ΔRGD составляла 12 ± 1, 5 ± 0,4, 8 ± 1 и 61 ± 4 относительных единицы соответственно (A, C). Чтобы дифференцировать уровни экспрессии генов между сетчаткой и RPE, количественную RT-PCR проводили отдельно на сетчатке и RPE / сосудистой оболочке. Мы обнаружили, что по сравнению с Ad5, экспрессия трансгена из Ad5ΔRGD была увеличена в 12 ± 3 раза в сетчатке, тогда как экспрессия трансгена из Ad5 / F35 и Ad5 / F37 снизилась в 9 ± 1 раз и в 3 ± 1 раз в сетчатке. сетчатка соответственно (D).Хотя Ad5ΔRGD изначально был разработан для снижения тропизма к RPE и, следовательно, для перенаправления вирусного тропизма в сторону фоторецепторов, мы обнаружили, что по сравнению с Ad5 экспрессия трансгена из RPE, трансдуцированного Ad5ΔRGD, увеличилась в 11-7 раз (E). Следовательно, более высокая трансдукция фоторецепторов могла быть частично достигнута за счет большего инфицирования вирусом Ad5ΔRGD в сетчатке. Это удивительно, учитывая, что важный компонент проникновения аденовируса, интегрин-связывающий RGD-домен в основании пентона, удален в этом вирусе.Напротив, экспрессия трансгена в инфицированных Ad5 / F35 и Ad5 / F37 RPE была снижена в 160 ± 38 раз и 4 ± 2 раза соответственно (E).
Для определения конкретных типов клеток сетчатки, инфицированных каждым вирусом, мы приготовили замороженные срезы сетчатки животных, которым вводили инъекции в субретинальное пространство. Как и ожидалось, флуоресценция GFP была четко видна в RPE всех инъецированных животных. Однако также была отмечена трансдукция различных типов клеток в сетчатке. Как описано ранее, Ad5 инфицировал небольшое количество фоторецепторных клеток (A).Однако, в отличие от предыдущих исследований, наш вирус Ad5 / F35 или Ad5 / F37 не оказывал значительного заражения фоторецепторами, по крайней мере, в той степени, в которой это можно было обнаружить при наблюдении прямой флуоресценции GFP. В то время как Ad5 / F35 инфицировал только RPE, Ad5 / F37 инфицировал в первую очередь клетки Мюллера в сетчатке (в дополнение к RPE) (B, C), в зависимости от клеточной морфологии. Трансдукция клеток Мюллера была дополнительно подтверждена путем определения антител против глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и клеточного ретинальдегид-связывающего белка (CRALBP;).GFP легко обнаруживался в теле фоторецепторных клеток, а также во внутренних и внешних сегментах сетчатки, трансдуцированной Ad5ΔRGD при случайной трансдукции клеток Мюллера. Однако имелась некоторая вариабельность паттерна экспрессии GFP в ONL с Ad5ΔRGD; в некоторых случаях спорадические GFP-положительные клеточные тела имели цитоплазматический паттерн экспрессии, а в других случаях перинуклеарный GFP наблюдался в ONL. В обоих случаях внутренний и внешний сегменты также были GFP-положительными (D, E).
Флуоресцентная микроскопия поперечных срезов сетчатки, инфицированных Ad5, Ad5 / F35, Ad5 / F37 и Ad5ΔRGD, показывает, что, хотя все они трансдуцируют RPE, каждый имеет свой тропизм для определенных типов клеток сетчатки.( A ) Ad5 трансдуцирует небольшую часть фоторецепторов и рассеянных клеток Мюллера. ( B ) Ad5 / F35 преобразует только RPE без обнаруживаемого GFP, очевидного в сетчатке. ( C ) Ad5 / F37 трансдуцирует в основном клетки Мюллера в сетчатке (в дополнение к RPE). ( D ) Ad5ΔRGD в основном трансдуцирует фоторецепторы, но также трансдуцирует рассеянные клетки Мюллера. ( E ) В некоторых областях сетчатки фоторецепторы, трансдуцированные Ad5ΔRGD, обнаруживают GFP в цитоплазме только в ONL, а также во внутреннем и внешнем сегментах.РПЭ, пигментный эпителий сетчатки; ONL, внешний ядерный слой; INL, внутренний ядерный слой; GCL, слой ганглиозных клеток.
Слой клеток сетчатки, наиболее эффективно трансдуцируемый Ad5ΔRGD, является внешним ядерным слоем
Мы обнаружили, что Ad5ΔRGD имеет наибольшую экспрессию трансгена в сетчатке по сравнению с Ad5, Ad5 / F35 и Ad5 / F37 и что он трансдуцирует ряд типов клеток. . Чтобы определить долю трансдуцированных клеток в ONL по сравнению с INL, мы использовали полуколичественный подход, включающий модифицированный стереологический метод (StereoInvestigator; Micro Brightfield).Вкратце, были взяты серийные срезы по всему квадранту глаза, показывающие экспрессию GFP. Стереологическую сетку помещали на сетчатку каждого десятого участка ROI, подсчитывали общее количество GFP-положительных клеток и сравнивали с общим количеством клеток как для ONL, так и для INL. Мы обнаружили, что из 52 739 ± 0,04 общих клеток в ONL трансдуцировались 11 507 ± 0,1 клеток (22%) (A, C). В INL было всего 12 816 ± 0,06 клеток, из которых 1381 ± 0,3 (11%) были трансдуцированы (B, C).Трансдуцированные клетки INL имели тенденцию встречаться отдельными участками и, вероятно, соответствовали клеткам Мюллера, тогда как клетки ONL были равномерно распределены (B, D).
Срезы области трансдукции, используемые для модифицированной стереологии для определения частей клеток, трансдуцированных в ONL и INL. ( A ) Количество трансдуцированных клеток по отношению к общему количеству клеток в ONL. ( B ) Число трансдуцированных клеток относительно общего числа клеток в INL. ( C ) 22% клеток в ONL трансдуцировались, тогда как 11% трансдуцировались в INL.( D ) Флуоресцентные микрофотографии, используемые для определения клеток, трансдуцированных в ONL / INL.
Экспрессия фоторецепторного трансгена из векторов Ad5ΔRGD
Продемонстрировав, что векторы Ad5ΔRGD могут трансдуктировать клетки сетчатки более эффективно, чем Ad5, Ad5 / F35 или Ad5 / F37, мы попытались изучить возможность достижения экспрессии трансгена, специфичного для фоторецепторов, из аденовируса. векторы. Ранее мы продемонстрировали экспрессию трансгена, специфичного для фоторецепторов, in vivo с использованием аденовирусных векторов, содержащих 4.Промотор опсина мышиного стержня размером 7 т.п.н. 14 Однако экспрессия трансгена от такого промотора достигается только в отдельных участках сетчатки. Следовательно, мы создали аденовирусный вектор (Ad5sRhoGFPΔRGD), экспрессирующий GFP, регулируемый 257 п.н. из 5′-консервативной области энхансера / промотора гена опсина палочек мыши (A). Ранее было показано, что этот промотор является специфичным для фоторецепторов в контексте аденоассоциированного вируса. 22 Всего 10 9 вирусных частиц Ad5sRhoGFPΔRGD инъецировали в субретинальное пространство взрослых мышей C57BL6J и исследовали через 14 дней после инъекции в замороженных срезах.Была обнаружена значительная экспрессия GFP, ограниченная ONL, которая содержала в основном тела фоторецепторных клеток (B). Кроме того, мы наблюдали значительные уровни GFP во внутренних и внешних сегментах фоторецепторов.
Структура конструкции Ad5sRhoGFPΔRGD. ( A ) Энхансер / промотор опсина мыши (sRho) длиной 257 п.о., управляющий экспрессией кассеты EGFP, вставляли в вектор Ad5ΔRGD в антисмысловой ориентации в удаленную область E1. ( B ) Флуоресцентная микрофотография поперечного среза сетчатки через 14 дней после субретинальной инъекции 10 9 вирусных частиц указывает на устойчивую экспрессию, ограниченную только фоторецепторами.
Обсуждение
Жизнеспособность аденовируса в качестве вектора генной терапии для глазных заболеваний недавно была продемонстрирована в двух клинических испытаниях: одно доставляет PEDF для лечения возрастной дегенерации желтого пятна, а другое доставляет тимидинкиназу для лечения ретинобластомы. 4 , 5 В настоящее время 221 мутация связана с дегенерацией сетчатки (http://www.sph.uth.tmc.edu/retnet/disease.htm). Многие из этих белков имеют решающее значение для правильного функционирования каскада фототрансдукции и экспрессируются исключительно в фоторецепторах.Одним из основных недостатков использования аденовируса в глазу является неэффективная трансдукция фоторецепторных клеток. Три аденовирусных вектора, содержащие модификацию капсидных белков Ad5, были ранее описаны для повышения трансдукции фоторецепторов. 14 — 16 Здесь мы впервые напрямую сравниваем Ad5, Ad5 / F35, Ad5 / F37 и Ad5ΔRGD с использованием одного и того же промотора, кассеты экспрессии трансгена, инъекций и методов обнаружения.Наши результаты показывают, что каждый вектор имеет особый тропизм для определенных типов клеток сетчатки. Наши результаты отличаются от более ранних отчетов, которые показали, что Ad5 / F35 и Ad5 / F37 обладают повышенной трансдукцией фоторецепторов по сравнению с Ad5.
Ранее было показано, что Ad5 / F35 преобразует РПЭ и фоторецепторы. 15 В нашем исследовании Ad5 / F35 преобразовывал исключительно RPE и с эффективностью в 160 раз меньше, чем Ad5. Однако между этими исследованиями есть различия.Мы использовали промотор CBA, тогда как ранее исследователи использовали промотор CMV. Однако ранее мы показали, что, в отличие от промотора CMV, промотор CBA позволяет нам наблюдать трансдукцию Ad5 фоторецепторов. Мы не усиливали сигнал GFP с помощью антитела. Однако в наших исследованиях экспрессия Ad5 наблюдалась без необходимости в антителе GFP. Следовательно, Ad5 / F35 оказался менее эффективным в трансдукции фоторецепторов, чем Ad5.
Мы показали, что, как и Ad5 / F35, использованный в предыдущих исследованиях, Ad5 / F35 более эффективно трансдуцирует клетки, экспрессирующие CD46 человека, чем Ad5, 15 Ad5 / F37 или Ad5ΔRGD.Необходимость более высокого MOI для Ad5 / F35 по сравнению с Ad5 для достижения того же уровня трансдукции в клетках HEPA 1c1c7 является дополнительным свидетельством перенаправления тропизма от рецептора Ad5 и, возможно, может быть дополнительно объяснена ранее опубликованными наблюдениями низкой экспрессии CD46 в гепатоцитах мышей. 23 Хотя мыши действительно несут ген CD46, некоторые сообщают, что экспрессия ограничена семенниками, 24 , тогда как другие указывают на экспрессию фоторецепторами. 15 Нам не удалось получить коммерчески доступное антитело к CD46 мыши, но мы протестировали несколько тканей мышей на экспрессию с помощью количественной ОТ-ПЦР с использованием праймеров к CD46 мыши. Наши данные согласуются с сообщениями о том, что семенники мышей имеют наибольшее количество CD46 и что уровни значительно снижаются в печени, сетчатке и RPE / сосудистой оболочке (данные не показаны). Было показано, что мышиный гомолог CD46 человека, crry, имеет сходный паттерн экспрессии и выполняет сравнимую роль в системе комплемента. 25 Однако неизвестно, способен ли Ad5 / F35 связывать crry. Экспрессия в сетчатке как crry у мышей, так и CD46 у людей наиболее распространена в RPE, где она ограничена базальной и латеральной поверхностями клеток RPE. 26 Поскольку Ad5 / F35 вводится в субретинальное пространство, он подвергается воздействию апикальной стороны RPE, ограничивая доступ к crry. Это могло быть другим объяснением менее эффективной трансдукции RPE с помощью Ad5 / F35.
Помимо RPE, мы наблюдали опосредованную Ad5 / F37 экспрессию GFP в процессах клеток Мюллера на внутренней и внешней ограничивающих мембранах и, возможно, на внутренних нейронах сетчатки. Это контрастирует с тем, что было обнаружено ранее 16 , в котором преобразовывались как РПЭ, так и фоторецепторы. Это можно объяснить несколькими различиями в нашем подходе: (1) Мы использовали промотор CBA, тогда как более ранние исследователи использовали промотор CMV. (2) Было одно аминокислотное различие между волокном F37, используемым в нашем исследовании, и волокном в более ранних исследованиях (в нашем есть треонин в положении 10, но в предыдущих исследованиях есть аспарагиновая кислота).(3) Наш способ инъекции был субретинальным по сравнению с ранее использовавшейся интравитреальной доставкой. Однако было бы удивительно, что вирусная диффузия будет обходить фоторецепторы, которые поглощаются клетками Мюллера после субретинальной инъекции. Мы наблюдали такую же картину экспрессии после инъекции вируса Ad5 / F17 14 ; оба были классифицированы как аденовирусы подгруппы D. Было показано, что Ad37 связывается с сиаловой кислотой. 13 Хотя сиаловая кислота присутствует по всей сетчатке, по-видимому, она не экспрессируется преимущественно на более высоких уровнях на клетках Мюллера (данные не показаны).Также было показано, что Ad37 имеет более высокое сродство связывания с интегрином, чем Ad5. 21 Это могло бы объяснить наше наблюдение сниженной трансдукции клеток Y79 с помощью Ad5 / F37, которые действительно экспрессируют сиаловую кислоту, но очень мало интегрина α v .
Было показано, что клетки Мюллера экспрессируют четыре субъединицы интегрина (α 1 , α 2 , α 3 и β 1 ). 27 Было бы интересно посмотреть, усиливает ли эта комбинация экспрессии интегрина и сиаловой кислоты на клетках Мюллера трансдукцию Ad5 / F37 по сравнению с другими тестируемыми векторами.Было показано, что клетки Мюллера становятся фагоцитарными при попадании в глаз инородных частиц. 28 Следовательно, другое возможное объяснение может заключаться в том, что клетки Мюллера активируются Ad5 / F37, а затем фагоцитируют вирус.
Наша конструкция Ad5ΔRGD была разработана для устранения связывания интегрина с целью снижения захвата вируса RPE, направляя вирус на соседние фоторецепторы. С этой целью мы действительно наблюдали значительно повышенную экспрессию в фоторецепторах по сравнению со всеми другими протестированными векторами.Более удивительно то, что мы наблюдали повышенное количество трансдукции RPE по сравнению с Ad5. Это указывает на то, что, по крайней мере, в контексте RPE, связывание интегрина может не иметь решающего значения для захвата Ad5. Помимо повышенной трансдукции фоторецепторов по сравнению с Ad5, мы также наблюдали другой паттерн экспрессии внутри клеток. В некоторых случаях все тело фоторецепторной клетки вместе с внутренним / внешним сегментами содержало GFP. В других регионах экспрессия GFP в теле клетки, наряду с внутренними / внешними сегментами, экспрессирующими GFP, оказалась цитоплазматической.Возможное объяснение двух различных паттернов экспрессии может быть результатом количества GFP, экспрессируемого клеткой. Трансген GFP, используемый в нашем исследовании, не имеет сигнала ядерной локализации, и поэтому у нас нет оснований полагать, что он проникает в ядро с высокой эффективностью. Возможно, что ядерное поглощение и связывание GFP зависят от концентрации и что исключительная перинуклеарная локализация происходит в тех фоторецепторах, которые содержат меньше вирусных частиц на клетку.То, что все четыре вектора имеют различный тропизм в сетчатке, но при этом инфицируют RPE, предполагает возможный неизвестный механизм захвата вируса RPE. Одна из функций RPE — фагоцитировать внешние сегменты фоторецепторов. 29 Это может быть одним из объяснений того, как любой модифицированный аденовирусный вектор проникает в RPE независимо от его тропизма в слоях сетчатки.
Поместив экспрессию GFP под контроль энхансера / промотора мышиного опсина длиной 257 пар оснований (sRho), мы смогли обеспечить устойчивую экспрессию, которая была ограничена фоторецепторами.Паттерн экспрессии соответствовал паттерну, наблюдаемому при использовании аденоассоциированных вирусных векторов, со всем телом клетки и внутренними / внешними сегментами, содержащими GFP. 21 Однако это не согласуется с данными, описанными для невирусных векторов доставки генов, в которых внутренние сегменты не имеют экспрессии GFP. 30 Насколько нам известно, это первый отчет о надежной экспрессии фоторецептор-специфичного трансгена из аденовирусного вектора.
Подводя итог, наши данные предполагают, что либо изменение волокна, либо удаление домена RGD в основании пентона может быть достаточным для усиления аденовирусной трансдукции различных типов клеток в сетчатке.Мы показываем, что Ad5 / F35 нацелен на RPE, Ad5 / F37 нацелен на RPE и клетки Мюллера, а Ad5ΔRGD нацелен на RPE, фоторецепторы и некоторые клетки Мюллера. Наконец, мы показываем, что надежная экспрессия может быть ограничена фоторецепторами с помощью промотора мышиного опсина длиной 257 пар оснований в конструкции Ad5ΔRGD. Эти данные имеют отношение к разработке векторов для переноса генов на основе аденовирусов, специально нацеленных на те популяции клеток, которые поражены различными ретинопатиями.
ORACLE Lighting VECTOR ™ Demon Eye ColorSHIFT Комплект для преобразования проектора
ORACLE Номер детали 5856-334
Поднимите свои светодиодные излучатели ORACLE Lighting VECTOR ™ Grill на новый уровень с новым комплектом для освещения проектора ORACLE «Demon Eye» ColorSHIFT.Это мощное светодиодное устройство ColorSHIFT предварительно установлено в излучателях, что позволяет освещать или подсвечивать линзы, придавая грилю VECTOR ™ Grill вид «Глаза демона». Используя один из наших контроллеров ColorSHIFT, вы можете изменять цвета по своей команде. (Контроллер ColorSHIFT продается отдельно.)
Светодиодный светодиодный излучатель ближнего света ORACLE Технические характеристики:
— Общий световой поток 4000 люмен
— 24 светодиода Phillips ZES ™ 5 Вт
— Предварительно установленный ColorSHIFT Demon Eye
— Регулировка по горизонтали и вертикали
— Разработан исключительно для гриля Vector ™
— Усовершенствованная конструкция оптики для оптимальной видимости
— Прецизионный световой выход без бликов
— Простая самостоятельная установка «подключи и работай»
— Гарантия 2 года
ORACLE LED Driving Beam Технические характеристики светодиодного излучателя:
— Общий световой поток 1600 люмен
— 6 светодиодов Phillips ZES ™ 5 Вт
— Предварительно установленный ColorSHIFT Demon Eye
— Регулировка по горизонтали и вертикали
— Разработан исключительно для Vector ™ Grill
— Усовершенствованная конструкция оптики для оптимальной видимости
— Прецизионный световой выход без бликов
— Простая самостоятельная установка «подключи и работай»
— Гарантия 2 года
Технические характеристики светодиодного излучателя дальнего света ORACLE:
— Дополнительный световой поток 1600 люмен
— 6 светодиодов Phillips ZES ™ 5 Вт
— Предустановленная система ColorSHIFT Demon Eye
— Регулировка по горизонтали и вертикали
— Разработана исключительно для Vector ™ Grill
— Advanced Конструкция оптики для оптимальной видимости
— Полная конструкция с высокой выходной мощностью
— Простая самостоятельная установка «Plug and Play»
— 2 года гарантии
Содержимое упаковки:
(4) Регулируемые светодиодные излучатели ближнего света с установленным глазом демона ColorSHIFT.
(2) Регулируемые светодиодные излучатели дальнего света с установленным глазом демона ColorSHIFT.
(2) светодиодных излучателя дальнего света (яркого света) с установленным глазом демона ColorSHIFT.
Выбор контроллера:
Чтобы управлять функцией изменения цвета этих источников света, вам необходимо выбрать светодиодный контроллер ColorSHIFT. Узнайте больше о наших различных типах контроллеров ColorSHIFT, чтобы подобрать идеальный стиль для вас, посмотрев видео с обзором контроллера.
